3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ 7/2014 đến 12/2014
Địa điểm: Phòng Công nghệ Enzyme, Phòng Sinh hóa, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Các thiết bị sử dụng bao gồm: Hệ thống điện di Mini protean (Bio Rad), hệ thống sắc ký (Bio Rad), tủ ủ vi sinh vật Memmert, tủ cấy vô trùng Esco, máy đo quang phổ máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417R, máy lắc ủ Eppendorf (Đức), bếp đun cách thủy Prolabo…,
Các dụng cụ sử dụng bao gồm đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc thuỷ tinh hoặc nhựa, chai lọ thuỷ tinh, eppendorf, bộ micropipette Biorad…,
3.1.3. Nguyên vật liệu
Dòng vi khuẩn DD9 đồng hình với Bacilus subtilis RC24 ở mức độ 94% được lưu trữ tại Phòng Sinh hóa, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Bã mía thu được từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang sẽ được sấy ở 70oC trong 180 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu Retsch Miihle với kích thước lỗ lưới là 0,2 mm, xử lý lignin, rửa lại với nước lọc nhiều lần.
3.1.4. Hóa chất
Natri clorua (NaCl) (Trung Quốc), Magnesium sulfate (MgSO4) (Trung Quốc),
Dipotassium phosphate (K2HPO4) (Trung Quốc), Monopotassium phosphate
(KH2PO4) (Trung Quốc), Ammonium sulfate (NH4SO4) (Trung Quốc), Bovin Serum Albumin (Merck), Tris, β-mercaptoethanol (Merck), Acrylamide (Bio Rad), Sodium hydroxide (NaOH) (Trung Quốc), Sodium Dodecyl Sulfate (Merck), Bromophenol blue, Acetic acid (CH3COOH) (Trung Quốc), Hydrochloric acid (HCl) (Trung Quốc), CMC (Merk), congo Red (Merk), thuốc thử Nelson, thuốc thử Bradford, Glucose,
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Glycerol, Commassie blue G250, Glycine, Methanol, Ammonium persulfate, Tetramethylethylenediamine.
Gel trao đổi ion âm: Uno-Sphere Q.
Dung dịch protein chuẩn có trọng lượng phân tử trong khoảng 14,4 đến 116 kDa (Fermantas).
3.1.5. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật Môi trƣờng đặc Ryckeboer (2003) cải tiến
Bảng 1. Thành phần môi trƣờng cải tiến (M1)
(* Nguồn: Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh et al., 2010)
Môi trƣờng lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến
Bảng 2. Thành phần môi trƣờng cải tiến (M2)
Tên hóa chất Khối lƣợng/ Thể tích
Bột bã mía 10gram (NH4)2SO4 1gram KH2PO4 1gram K2HPO4 1gram MgSO4.7H2O 0,5gram NaCl 0,001gram Nước cất 1000 ml
(* Nguồn: Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh et al., 2010)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích
Bột bã mía 10 gram (NH4)2SO4 1 gram KH2PO4 1 gram K2HPO4 1 gram MgSO4.7H2O 0,5 gram NaCl 0,001 gram Agar 20 gram Nước cất 1000 ml
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp kết tủa
3.2.1.1. Kết tủa phân đoạn endoglucanase với Ammonium Sulfate (AS) bãohòa
Mục đích: Chọn nồng độ ammonium sulfate thích hợp cho quá trình thu hồi enzyme
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố AS với 6 mức 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% AS bão hòa.
Tiến hành thí nghiệm: Dịch trích enzyme thô được tủa phân đoạn với AS nồng độ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% AS bão hòa. Mỗi phân đoạn lần lượt được ly tâm 6000 vòng/20 phút, thu tủa hòa tan trong đệm Tris HCl 200mM pH 7, thẩm tích ở 4oC trong 24 giờ .
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp vòng tròn đường kính thủy phân
3.2.1.2. Kết tủa endoglucanase với ethanol
Mục đích: Chọn loại dung môi hữu cơ tối ưu và tỷ lệ trích ly thích hợp cho quá trình thu hồi enzyme
Bố trí thí nghiệm: Tỷ lệ dung dịch enzyme: ethanol (4oC) là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 Tiến hành thí nghiệm: Tiến hành tủa dịch trích enzyme thô với ethanol trong tủ lạnh -20oC theo tỷ lệ như đã bố trí ở trên, ly tâm 6000 vòng/20phút ở 40C loại bỏ dịch trong thu tủa, mở nắp để 30 phút cho ethanol bay hơi, hòa tan tủa trong dung dịch đệm Tris HCl 200mM pH 7
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
3.2.1.3. Kết tủa endoglucanase với acetone
Mục đích: Chọn loại dung môi hữu cơ tối ưu và tỷ lệ trích ly thích hợp cho quá trình thu hồi enzyme
Bố trí thí nghiệm: Tỷ lệ dung dịch enzyme: acetone (-20oC) là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 Tiến hành thí nghiệm: Tiến hành tủa dịch trích enzyme thô với acetone trong tủ lạnh - 20oC theo tỷ lệ như đã bố trí ở trên, ly tâm 6000 vòng/20phút ở 4oC loại bỏ dịch trong thu tủa, hòa tan tủa trong dung dịch đệm Tris HCl 200mM pH 7
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp vòng tròn đường kính thủy phân
3.2.2. Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion
Mục đích: Tách endoglucanase ra khỏi các tạp chất khác dựa vào điện tích bề mặt của protein
Tiến hành thí nghiệm:
a. Chuẩn bị gel: Cân 10 gram gel Uno – Sphere Q cho vào cốc chứa dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75 ngâm 1-2 ngày ở nhiệt độ phòng, rửa gel bằng dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75. Lặp lại quá trính rửa 2 lần.
b. Nhồi gel vào cột: Nhồi gel vào cột sắc ký (2,5x10cm). Cân bằng cột bằng dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75 (3 lần thể tích cột). Tốc độ dòng chảy 1ml/phút.
c. Bơm mẫu: 20ml dung dịch protein được giữ lại ở thí nghiệm 1 được bơm vào cột với tốc độ 1 ml/phút.
d. Rửa cột: Cột được rửa bằng dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75, theo dõi quá trình rửa cột qua sắc ký đồ đến khi protein không bám được đẩy ra hết khỏi cột. Tốc độ dòng chảy là 1 ml/phút.
Thu phân đoạn protein không bám.
e. Rửa giải enzyme: Rửa giải bằng gradient nồng độ muối NaCl từ 0M-1M, trong dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75, tốc độ dòng chảy 1 ml/phút. Thu các phân đoạn bằng máy sắc ký.
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Mỗi phân đoạn được tiến hành thẩm tích trong dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 7 trong 24 giờ ở 4oC.
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Hoạt tính enzyme bằng phương pháp vòng tròn đường kính thủy phân
Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của endoglucanase bằng phương pháp SDS-PAGE
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9
4.1.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp tủa phân đoạn với ammonium sulphate
900ml dịch enzyme thô được tiến hành tủa phân đoạn với ammonium sulphate ở 4oC từ 40% đến 90% bão hòa, trong 1 giờ. Kết quả protein thu được có hàm lượng và hoạt tính ở các phân đoạn được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3. Kết quả tủa phân đoạn với ammonium sulphate
Phân đoạn Thể tích (ml) Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U)
Hoạt tính đặc hiệu (Umg-1) Thô 900 54,3 4311 79,4 40% 21 1,48 255 172 50% 26 0,700 178 254 60% 12 4,09 135 33 70% 11 0,858 80 93 80% 9 0,22 34 153 90% 15 0,54 0 0
Từ kết quả bảng 1 cho thấy protein tủa ở các phân đoạn 40% đến 90% nhưng chỉ có hoạt tính ở các phân đoạn 40% đến 80%. Phân đoạn 40%, 50% có hàm lượng và hoạt tính cao lần lượt 1,48 mg, 0,7 mg, 255 U, 178 U. Hàm lượng protein phân đoạn 60% cao 4,09 mg nhưng cho hoạt tính đặc hiệu khá thấp có thể phân đoạn này đã tủa các protein không phải protein mục tiêu. Phân đoạn 80% mặc dù hàm lượng thấp nhưng có hoạt tính riêng khá cao.
Các nghiên cứu trên thế giới cũng đã cho thấy enzyme endoglucanase tủa với ammonium sulphate với nhiều nồng độ khác nhau Chen et al., (2004) tủa với 40%- 60% AS, Makky (2009) tủa enzyme với 60% AS và Yin et al., (2010) tủa với 60-80% AS. Kết quả thí nghiệm này tương tự với nghiên cứu của Sadhu et al., (2013) khi thu nhận, tinh sạch và khảo sát đặc tính của endoglucanase từ dòng vi khuẩn Bacillus
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
phân lập từ phân bò. Kết quả của bài báo cũng cho thấy endoglucanase thu nhận được khi tủa với ammonium sulphate phân đoạn 40–80%.
Trong năm phân đoạn có hoạt tính protein khi tủa với ammonium sulphate từ 40% đến 80% với tổng hàm lượng protein thu được là 7,35 mg, trong khi đó dịch enzyme thô ban đầu có hàm lượng 54,3 mg chứng tỏ còn một hàm lượng lớn protein trong dịch thô vẫn chưa kết tủa, bên cạnh đó có thể còn một số protein không phải protein mục tiêu tủa ở các phân đoạn điều này làm ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình tinh sạch, cần tiếp tục tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký ở bước tiếp theo.
Hình 11. Kết quả đƣờng kính vòng halo giữa các phân đoạn tủa AS
*Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng kí tự thể hiện sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5% và ngược lại, %CV = 13,94%
Dựa vào kết quả đường kính thủy phân và kết quả bảng 3 cho thấy endoglucanase thể hiện hoạt tính ở các phân đoạn tủa 40-80% ammonium sulphate, hai phân đoạn tủa enzyme với 40% và 50% ammonium sulphate thể hiện hoạt tính và độ tinh sạch khá cao, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các phân đoạn tủa còn lại. bc ab a c c c 0 1 2 3 4 5 6 7 8
THO 40%AS 50%AS 60%AS 70%AS 80%AS
Dịch enzyme Đư ờn g kính t h ủ y p h ân ( mm )
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
4.1.2 Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp tủa với ethanol Bảng 4. Kết quả tủa với ethanol
Tỷ lệ (v/v) Thể tích (ml) Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (Umg-1) Thô 200 12,1 958 79,4 1:1 8 0,248 43,1 174 1:2 8 0,864 53,9 62,4 1:3 6 0,473 31,7 67 1:4 6 0,590 0 0
Qua kết quả bảng 2 cho thấy protein khi tủa với ethanol có hoạt tính ở 3 tỷ lệ tủa 1:1, 1:2, 1:3. Ở tỷ lệ tủa enzyme: ethanol là 1:2 hàm lượng protein tổng và hoạt tính thu được cao nhất lần lượt là 0,864 mg và 53,9 U. Hoạt tính bắt đầu giảm xuống ở tỷ lệ tủa enzyme: ethanol là 1:3 và ở tỷ lệ tủa 1:4 không còn hoạt tính. Ở nồng độ ethanol quá cao protein bị biến tính không thuận nghịch và không thể hòa tan trở lại trong nước hay dung dịch đệm sau khi kết tủa. So sánh hàm lượng và hoạt tính protein thu được khi tủa với ethanol vẫn còn khá thấp so với dịch enzyme thô ban đầu cho thấy rằng đây chưa phải là phương pháp tối ưu cho tủa protein.
Hình 12. Kết quả đƣờng kính vòng halo giữa các tỷ lệ tủa ethanol
*Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng kí tự thể hiện sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5% và ngược lại, %CV = 7,94%.
c b a c d 0 1 2 3 4 5 6 7 8 THO E 1:1 E 1:2 E 1:3 E 1:4 Dịch enzyme Đư ờn g kính t h ủ y p h ân ( mm )
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Kết quả đường kính halo (hình 12) cho thấy có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% giữa các tỷ lệ tủa. Từ kết quả đường kính vòng halo kết hợp với kết quả bảng 4 có thể chọn tủa endoglucanase với ethanol thích hợp ở tỷ lệ 1:2.
4.1.3 Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp tủa với acetone Bảng 5. Kết quả tủa với acetone
Từ kết quả bảng 2 cho thấy ở các tỷ lệ nồng độ tủa enzyme thu được có hàm lượng và hoạt tính khác nhau, khi thể tích dung môi tăng thì hàm lượng protein và hoạt tính cũng tăng. Tuy nhiên ở tỷ lệ tủa enzyme: acetone 1:2 và 1:3 có hàm lượng protein cao hơn tỷ lệ tủa 1:1 nhưng có hoạt tính thấp hơn có thể trong quá trình tủa protein đã bị biến tính một phần vì các dung môi hữu cơ là các chất dễ gây biến tính khi tủa. Hàm lượng protein và hoạt tính lớn nhất thu được ở tỷ lệ tủa 1:4 lần lượt là 0,378 mg và 32,741 U. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Trần Thị Ánh Tuyết et al. (2010) với tỷ lệ tủa enzyme: acetone là 1:4.
Tỷ lệ (v/v) Thể tích
(ml) Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (Umg-1)
Thô 200 12,1 958 79,4 1:1 3 0,175 17,7 102 1:2 3 0,232 12,5 53,9 1:3 3 0,365 10,1 27,8 1:4 3 0,378 32,7 86,6
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Hình 13. Kết quả đƣờng kính vòng halo giữa các tỷ lệ tủa acetone
*Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng kí tự thể hiện sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5% và ngược lại, %CV = 7,29%
Từ kết quả bảng 5 kết hợp với kết quả đường kính vòng halo (hình 13) cho thấy khi tủa endoglucanase bằng acetone ở tỷ lệ 1:4 hoạt tính và độ tính sạch khá cao, thể hiện ở vòng tròn đường kính thủy phân với độ khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các tỷ lệ tủa còn lại. Vì vậy, tỷ lệ tủa endoglucanase: acetone1:4 (v/v) là nồng độ tối ưu cho tủa endoglucanase.
So sánh hiệu quả của ba phƣơng pháp tủa
Dịch enzyme tủa ammonium sulphate, ethanol, acetone được quy đổi về 100 ml. So sánh kết quả của ba thí nghiệm tinh sạch, nhận thấy khi tủa endoglucanase bằng muối ammonium sulphate có tổng hàm lượng và hoạt tính thu được lớn hơn gần 3 lần so với tủa với ethanol và acetone (bảng 4), điều này được giải thích dựa trên tác nhân gây kết tủa. Dung môi hữu cơ khi cho vào dịch enzyme làm giảm hằng số điện môi và tăng lực hấp dẫn giữa các phân tử protein mang điện tích trái dấu gây kết tủa protein, nhưng các dung môi hữu cũng có tác động hòa tan protein khi tủa, dung môi hữu cơ còn có khuynh hướng gây biến tính protein vì các tác động dehydrate hóa protein mạnh dễ dàng làm các phân tử protein bị duỗi ra, thay đổi cấu trúc gây biến tính. Các dung môi hữu cơ ethanol hay acetone có thể làm giảm hoạt tính cellulase từ 25-50% (Klose et al., 2012; Philippidis et al., 1993). Do đó cần cần thực hiện trong điều kiện lạnh để hạn chế khả năng biến tính. Hoạt tính đặc hiệu của mẫu tủa bằng ammonium
c b b c a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 THO A 1:1 A 1:2 A 1:3 A 1:4 Dịch enzyme Đư ờn g kính t h ủ y p h ân ( mm )
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
sulphate cao hơn so với mẫu tủa bằng ethanol và acetone, 92,7 Umg-1
(bảng 6) thể hiện độ tinh sạch khá cao. Vì vậy tủa enzyme với ammonium sulphate là phương pháp thích hợp cho việc tinh sạch protein và ít gây ra biến tính ở nồng độ muối cao.
Bảng 6. So sánh hiệu quả của ba phƣơng pháp tủa
Mẫu Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (Umg-1) Hiệu suất (%) Thô 6,03 479 79,4 100 Tủa AS 40-80% 0,817 75,7 93 15,8 Tủa ethanol 1:2 0,432 26,9 62,4 5,6 Tủa acetone 1:4 0,189 16,4 86,6 3,4
4.1.4 Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion âm
Dịch enzyme thu được sau khi tủa với ammonium sulphate đem sắc ký trao đổi ion âm với cột gel Uno Sphere Q. Kết quả thu được 6 phân đoạn lần lượt UB, F1, F1b, F2, F3, F4, F5 (hình 14)
Hình 14. Sắc ký đồ trên gel Uno Sphere Q
UB F1 F2 F3 F4 F5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1 7 13 19 25 31 37 43 49 55 61 67 73 79 85 91 97 103 109 115 N ồn g độ N aC l ( M) O D 280 nm
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Trong 6 phân đoạn thu được chỉ có 3 phân đoạn F1, F3 và F4 có hoạt tính, trong đó phân đoạn F3 có hàm lượng và hoạt tính (0, 965mg và 765 U) cao hơn nhiều so với 2 phân đoạn F1 và F4. Phân đoạn F1, F3, F4 được rửa giải lần lượt ở các nồng độ