2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Trong nước ta, đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về tinh sạch cellulase nói chung hay endoglucanase nói riêng trên vi khuẩn Bacillus được công bố. Các nghiên cứu trong nước chủ yếu chỉ tập trung vào cellulase thu nhận từ nấm.
Trịnh Đình Khá và ctv. (2007), tinh sạch sơ bộ và đánh giá tính chất hoá lý của cellulase từ chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sau khi tủa bằng 95% acetone hoặc ethanol cho hiệu suất thu hồi cao (69 - 52%) enzyme thu được có hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ 60oC và pH 4,5.
Trần Thạnh Phong và ctv. (2007), thu nhận enzyme cellulase của Trichoderma reesei trên môi trường bán rắn với cơ chất bã mía kết hợp với cám mì. Hoạt tính và hiệu suất sinh tổng hợp cellulase là 280,64 IU/g và FPU (Filter Paper Unit) là 5 IU/g.
Nghiêm Ngọc Minh và ctv. (2008), Nghiên cứu đặc điểm phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng vi khuẩn chịu nhiệt BSS2 phân lập tại bãi rác Nam Sơn –
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Hà Nội. Kết quả hoạt tính enzyme thu được là 0,138 U/ml với endo-β-1,4-glucanase và 0,07 U/ml với exo-β-1,4-glucanase.
Nghiêm Ngọc Minh và ctv. (2006), Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2. Kết quả, chủng XKS2 có hoạt tính endo- β-1,4-glucanase là 0,93 mg/ml trên môi trường rắn, 0,21 mg/ml trên môi trường dịch thể, exo-β-1,4 glucanase 0,22 mg/ml trên môi trường rắn và 0,102 mg/ml trên môi trường dịch thể.
2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc
Các nghiên cứu về tinh sạch endoglucanase trên các dòng Bacillus subtilis hiện vẫn còn rất hạn chế.
Aa et al. 1994 đã khảo sát khả năng sinh enzyme và đặc tính của endo-beta-1,4- glucanase từ Bacillus subtilis CK-2 phân lập từ phân hữu cơ trong đất. Kết quả hoạt tính cao nhất của enzyme thu được ở khoảng pH tối ưu 5,6-5,8 và nhiệt độ tối ưu 65oC. Enzyme tinh sạch bằng SDS-PAGE với trọng lượng phân tử 35,5 kDa và sắc ký lọc gel Sephadex G-75 vởi trọng lượng phân tử 70 kDa.
Baba et al. (2005) tinh sạch và khảo sát hoạt tính của endo-1,4-beta-D-glucanase mới từ Beltraniella portoricensis, với trọng lượng phân tử enzyme sau khi tinh sạch là 40 kDa được xác định bằng phương pháp SDS-PAGE, pH tối ưu là 4,5 và nhiệt độ tối ưu là 55o
C.
Bischoff et al. (2006) đã tinh sạch và khảo sát hoạt tính của endoglucanase từ loài vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus licheniformis với hoạt tính đặc hiệu 183 (U/mg), hiệu suất tinh sạch 17%.
Sadhu et al. 2013 đã tinh sạch và khảo sát hoạt tính, khả năng sinh endoglucanase từ chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ phân bò. Kết quả endoglucanase được tinh sạch gấp 8,5 lần so với dịch enzyme thô ban đầu, hiệu suất tinh sạch 68,1%, nhiệt độ tối ưu 50oC, pH tối ưu 7, trọng lượng phân tử protein thu được qua SDS-PAGE là 97 kDa.
Vijayaraghavan et al. (2011) cũng đã có báo cáo về kết quả tinh sạch carboxymethyl cellulase (Endoglucanase) từ một chủng Bacillus, được phân lập từ ruộng lúa. Kết quả enzyme được tinh sạch có hoạt tính đặc hiệu 246U/mg, độ tinh sạch
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
là 14,5 lần, trọng lượng phân tử là 58 kDa được xác định bằng phương pháp SDS- PAGE.
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ 7/2014 đến 12/2014
Địa điểm: Phòng Công nghệ Enzyme, Phòng Sinh hóa, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Các thiết bị sử dụng bao gồm: Hệ thống điện di Mini protean (Bio Rad), hệ thống sắc ký (Bio Rad), tủ ủ vi sinh vật Memmert, tủ cấy vô trùng Esco, máy đo quang phổ máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417R, máy lắc ủ Eppendorf (Đức), bếp đun cách thủy Prolabo…,
Các dụng cụ sử dụng bao gồm đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc thuỷ tinh hoặc nhựa, chai lọ thuỷ tinh, eppendorf, bộ micropipette Biorad…,
3.1.3. Nguyên vật liệu
Dòng vi khuẩn DD9 đồng hình với Bacilus subtilis RC24 ở mức độ 94% được lưu trữ tại Phòng Sinh hóa, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Bã mía thu được từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang sẽ được sấy ở 70oC trong 180 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu Retsch Miihle với kích thước lỗ lưới là 0,2 mm, xử lý lignin, rửa lại với nước lọc nhiều lần.
3.1.4. Hóa chất
Natri clorua (NaCl) (Trung Quốc), Magnesium sulfate (MgSO4) (Trung Quốc),
Dipotassium phosphate (K2HPO4) (Trung Quốc), Monopotassium phosphate
(KH2PO4) (Trung Quốc), Ammonium sulfate (NH4SO4) (Trung Quốc), Bovin Serum Albumin (Merck), Tris, β-mercaptoethanol (Merck), Acrylamide (Bio Rad), Sodium hydroxide (NaOH) (Trung Quốc), Sodium Dodecyl Sulfate (Merck), Bromophenol blue, Acetic acid (CH3COOH) (Trung Quốc), Hydrochloric acid (HCl) (Trung Quốc), CMC (Merk), congo Red (Merk), thuốc thử Nelson, thuốc thử Bradford, Glucose,
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Glycerol, Commassie blue G250, Glycine, Methanol, Ammonium persulfate, Tetramethylethylenediamine.
Gel trao đổi ion âm: Uno-Sphere Q.
Dung dịch protein chuẩn có trọng lượng phân tử trong khoảng 14,4 đến 116 kDa (Fermantas).
3.1.5. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật Môi trƣờng đặc Ryckeboer (2003) cải tiến
Bảng 1. Thành phần môi trƣờng cải tiến (M1)
(* Nguồn: Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh et al., 2010)
Môi trƣờng lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến
Bảng 2. Thành phần môi trƣờng cải tiến (M2)
Tên hóa chất Khối lƣợng/ Thể tích
Bột bã mía 10gram (NH4)2SO4 1gram KH2PO4 1gram K2HPO4 1gram MgSO4.7H2O 0,5gram NaCl 0,001gram Nước cất 1000 ml
(* Nguồn: Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh et al., 2010)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích
Bột bã mía 10 gram (NH4)2SO4 1 gram KH2PO4 1 gram K2HPO4 1 gram MgSO4.7H2O 0,5 gram NaCl 0,001 gram Agar 20 gram Nước cất 1000 ml
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp kết tủa
3.2.1.1. Kết tủa phân đoạn endoglucanase với Ammonium Sulfate (AS) bãohòa
Mục đích: Chọn nồng độ ammonium sulfate thích hợp cho quá trình thu hồi enzyme
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố AS với 6 mức 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% AS bão hòa.
Tiến hành thí nghiệm: Dịch trích enzyme thô được tủa phân đoạn với AS nồng độ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% AS bão hòa. Mỗi phân đoạn lần lượt được ly tâm 6000 vòng/20 phút, thu tủa hòa tan trong đệm Tris HCl 200mM pH 7, thẩm tích ở 4oC trong 24 giờ .
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp vòng tròn đường kính thủy phân
3.2.1.2. Kết tủa endoglucanase với ethanol
Mục đích: Chọn loại dung môi hữu cơ tối ưu và tỷ lệ trích ly thích hợp cho quá trình thu hồi enzyme
Bố trí thí nghiệm: Tỷ lệ dung dịch enzyme: ethanol (4oC) là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 Tiến hành thí nghiệm: Tiến hành tủa dịch trích enzyme thô với ethanol trong tủ lạnh -20oC theo tỷ lệ như đã bố trí ở trên, ly tâm 6000 vòng/20phút ở 40C loại bỏ dịch trong thu tủa, mở nắp để 30 phút cho ethanol bay hơi, hòa tan tủa trong dung dịch đệm Tris HCl 200mM pH 7
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
3.2.1.3. Kết tủa endoglucanase với acetone
Mục đích: Chọn loại dung môi hữu cơ tối ưu và tỷ lệ trích ly thích hợp cho quá trình thu hồi enzyme
Bố trí thí nghiệm: Tỷ lệ dung dịch enzyme: acetone (-20oC) là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 Tiến hành thí nghiệm: Tiến hành tủa dịch trích enzyme thô với acetone trong tủ lạnh - 20oC theo tỷ lệ như đã bố trí ở trên, ly tâm 6000 vòng/20phút ở 4oC loại bỏ dịch trong thu tủa, hòa tan tủa trong dung dịch đệm Tris HCl 200mM pH 7
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp vòng tròn đường kính thủy phân
3.2.2. Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion
Mục đích: Tách endoglucanase ra khỏi các tạp chất khác dựa vào điện tích bề mặt của protein
Tiến hành thí nghiệm:
a. Chuẩn bị gel: Cân 10 gram gel Uno – Sphere Q cho vào cốc chứa dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75 ngâm 1-2 ngày ở nhiệt độ phòng, rửa gel bằng dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75. Lặp lại quá trính rửa 2 lần.
b. Nhồi gel vào cột: Nhồi gel vào cột sắc ký (2,5x10cm). Cân bằng cột bằng dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75 (3 lần thể tích cột). Tốc độ dòng chảy 1ml/phút.
c. Bơm mẫu: 20ml dung dịch protein được giữ lại ở thí nghiệm 1 được bơm vào cột với tốc độ 1 ml/phút.
d. Rửa cột: Cột được rửa bằng dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75, theo dõi quá trình rửa cột qua sắc ký đồ đến khi protein không bám được đẩy ra hết khỏi cột. Tốc độ dòng chảy là 1 ml/phút.
Thu phân đoạn protein không bám.
e. Rửa giải enzyme: Rửa giải bằng gradient nồng độ muối NaCl từ 0M-1M, trong dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75, tốc độ dòng chảy 1 ml/phút. Thu các phân đoạn bằng máy sắc ký.
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Mỗi phân đoạn được tiến hành thẩm tích trong dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 7 trong 24 giờ ở 4oC.
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Hoạt tính enzyme bằng phương pháp vòng tròn đường kính thủy phân
Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của endoglucanase bằng phương pháp SDS-PAGE
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9
4.1.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp tủa phân đoạn với ammonium sulphate
900ml dịch enzyme thô được tiến hành tủa phân đoạn với ammonium sulphate ở 4oC từ 40% đến 90% bão hòa, trong 1 giờ. Kết quả protein thu được có hàm lượng và hoạt tính ở các phân đoạn được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3. Kết quả tủa phân đoạn với ammonium sulphate
Phân đoạn Thể tích (ml) Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U)
Hoạt tính đặc hiệu (Umg-1) Thô 900 54,3 4311 79,4 40% 21 1,48 255 172 50% 26 0,700 178 254 60% 12 4,09 135 33 70% 11 0,858 80 93 80% 9 0,22 34 153 90% 15 0,54 0 0
Từ kết quả bảng 1 cho thấy protein tủa ở các phân đoạn 40% đến 90% nhưng chỉ có hoạt tính ở các phân đoạn 40% đến 80%. Phân đoạn 40%, 50% có hàm lượng và hoạt tính cao lần lượt 1,48 mg, 0,7 mg, 255 U, 178 U. Hàm lượng protein phân đoạn 60% cao 4,09 mg nhưng cho hoạt tính đặc hiệu khá thấp có thể phân đoạn này đã tủa các protein không phải protein mục tiêu. Phân đoạn 80% mặc dù hàm lượng thấp nhưng có hoạt tính riêng khá cao.
Các nghiên cứu trên thế giới cũng đã cho thấy enzyme endoglucanase tủa với ammonium sulphate với nhiều nồng độ khác nhau Chen et al., (2004) tủa với 40%- 60% AS, Makky (2009) tủa enzyme với 60% AS và Yin et al., (2010) tủa với 60-80% AS. Kết quả thí nghiệm này tương tự với nghiên cứu của Sadhu et al., (2013) khi thu nhận, tinh sạch và khảo sát đặc tính của endoglucanase từ dòng vi khuẩn Bacillus
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
phân lập từ phân bò. Kết quả của bài báo cũng cho thấy endoglucanase thu nhận được khi tủa với ammonium sulphate phân đoạn 40–80%.
Trong năm phân đoạn có hoạt tính protein khi tủa với ammonium sulphate từ 40% đến 80% với tổng hàm lượng protein thu được là 7,35 mg, trong khi đó dịch enzyme thô ban đầu có hàm lượng 54,3 mg chứng tỏ còn một hàm lượng lớn protein trong dịch thô vẫn chưa kết tủa, bên cạnh đó có thể còn một số protein không phải protein mục tiêu tủa ở các phân đoạn điều này làm ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình tinh sạch, cần tiếp tục tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký ở bước tiếp theo.
Hình 11. Kết quả đƣờng kính vòng halo giữa các phân đoạn tủa AS
*Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng kí tự thể hiện sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5% và ngược lại, %CV = 13,94%
Dựa vào kết quả đường kính thủy phân và kết quả bảng 3 cho thấy endoglucanase thể hiện hoạt tính ở các phân đoạn tủa 40-80% ammonium sulphate, hai phân đoạn tủa enzyme với 40% và 50% ammonium sulphate thể hiện hoạt tính và độ tinh sạch khá cao, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các phân đoạn tủa còn lại. bc ab a c c c 0 1 2 3 4 5 6 7 8
THO 40%AS 50%AS 60%AS 70%AS 80%AS
Dịch enzyme Đư ờn g kính t h ủ y p h ân ( mm )
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
4.1.2 Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp tủa với ethanol Bảng 4. Kết quả tủa với ethanol
Tỷ lệ (v/v) Thể tích (ml) Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (Umg-1) Thô 200 12,1 958 79,4 1:1 8 0,248 43,1 174 1:2 8 0,864 53,9 62,4 1:3 6 0,473 31,7 67 1:4 6 0,590 0 0
Qua kết quả bảng 2 cho thấy protein khi tủa với ethanol có hoạt tính ở 3 tỷ lệ tủa 1:1, 1:2, 1:3. Ở tỷ lệ tủa enzyme: ethanol là 1:2 hàm lượng protein tổng và hoạt tính thu được cao nhất lần lượt là 0,864 mg và 53,9 U. Hoạt tính bắt đầu giảm xuống ở tỷ lệ tủa enzyme: ethanol là 1:3 và ở tỷ lệ tủa 1:4 không còn hoạt tính. Ở nồng độ ethanol quá cao protein bị biến tính không thuận nghịch và không thể hòa tan trở lại trong nước hay dung dịch đệm sau khi kết tủa. So sánh hàm lượng và hoạt tính protein thu được khi tủa với ethanol vẫn còn khá thấp so với dịch enzyme thô ban đầu cho thấy rằng đây chưa phải là phương pháp tối ưu cho tủa protein.
Hình 12. Kết quả đƣờng kính vòng halo giữa các tỷ lệ tủa ethanol
*Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng kí tự thể hiện sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5% và ngược lại, %CV = 7,94%.
c b a c d 0 1 2 3 4 5 6 7 8 THO E 1:1 E 1:2 E 1:3 E 1:4 Dịch enzyme Đư ờn g kính t h ủ y p h ân ( mm )
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Kết quả đường kính halo (hình 12) cho thấy có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% giữa các tỷ lệ tủa. Từ kết quả đường kính vòng halo kết hợp với kết quả bảng 4 có thể chọn tủa endoglucanase với ethanol thích hợp ở tỷ lệ 1:2.
4.1.3 Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp tủa với acetone Bảng 5. Kết quả tủa với acetone
Từ kết quả bảng 2 cho thấy ở các tỷ lệ nồng độ tủa enzyme thu được có hàm lượng và hoạt tính khác nhau, khi thể tích dung môi tăng thì hàm lượng protein và hoạt tính cũng tăng. Tuy nhiên ở tỷ lệ tủa enzyme: acetone 1:2 và 1:3 có hàm lượng protein cao hơn tỷ lệ tủa 1:1 nhưng có hoạt tính thấp hơn có thể trong quá trình tủa protein đã bị biến tính một phần vì các dung môi hữu cơ là các chất dễ gây biến tính khi tủa. Hàm lượng protein và hoạt tính lớn nhất thu được ở tỷ lệ tủa 1:4 lần lượt là 0,378 mg và 32,741 U. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Trần Thị Ánh Tuyết et al. (2010) với tỷ lệ tủa enzyme: acetone là 1:4.
Tỷ lệ (v/v) Thể tích
(ml) Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (Umg-1)
Thô 200 12,1 958 79,4 1:1 3 0,175 17,7 102 1:2 3 0,232 12,5 53,9 1:3 3 0,365 10,1 27,8 1:4 3 0,378 32,7 86,6
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học