2.6.1. Giới thiệu
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do: có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh vực khác.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hợp chất có thể phân tích bằng sắc ký lỏng như acid amin, protein, acid nucleic, hydrocacbon, carbohydrate, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu, các hợp chất vô cơ… Dựa vào sự khác nhau về cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà người ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến. Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng pha thường và sắc ký lỏng pha đảo.
-Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động, dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.
-Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký pha thường, pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn. Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa. Dung môi sử dụng là dung môi phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền, do đó sắc ký lỏng pha đảo được sử dụng nhiều nhất.
2.6.2. Các bộ phận của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính: bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký phân tích, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu.
Mẫu sau khi được tiêm vào cột sẽ được pha động lôi kéo qua cột. Dựa vào khả năng tương tác khác nhau giữa các chất có trong nền mẫu với pha tĩnh và pha động mà chúng được tách ra khỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi bộ dò cụ thể. Sắc ký lỏng có thể ghép với nhiều loại đầu dò khác nhau như đầu dò phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis, đầu dò huỳnh quang FLD, đầu dò chỉ số khúc xạ RID, đầu dò điện hóa ECD, đầu dò khối phổ MS… Hiện nay đầu dò khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong phân tích vết và các hợp chất nhận danh chính xác.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu:
Các loại đậu: đậu xanh, đậu trắng, đậu đen, đậu đỏ, đậu nành, đậu phộng được mua từ chợ Xuân Khánh.
- Đậu xanh (Vigna radiata)
- Đậu trắng (Vigna unguiculata)
- Đậu đen (Vigna cylindrica)
- Đậu đỏ (Vigna angularis)
- Đậu nành (Glycine max)
- Đậu phộng (Arachis hypogaea)
Loại bỏ những hạt bị sâu và các tạp chất lẫn trong đậu nếu có.
3.1.2. Hóa chất:
Methanol, NaOH, HCl, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), thuốc thử Folin- Ciocalteu, Na2CO3, FeCl3, phosphate buffer (pH 6,6), K3Fe(CN)6, trichloroacetic acid (TCA) và các hóa chất khác.
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ:
Thiết bị: tủ lạnh (SANYO – Nhật), tủ đông (SANAKY – Nhật), cân điện tử (Adventure – M ), máy đo quang phổ U-1500 (Hitachi – Nhật), máy khuấy từ (Heidolph – Đức), máy ủ lắc (Eppendorf – Đức), và một số thiết bị khác.
Dụng cụ: bình tam giác, ống nghiệm, micropipette, và một số dụng cụ khác.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu:
Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm công nghệ enzyme, viện NC&PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.2.2. Chuẩn bị hạt nảy mầm
Ngâm đậu với nước ở 35oC trong 5 giờ, sau đó rút hết nước. Rải đều đậu vào hộp nhựa có lót sẵn vải mềm. Bọc hộp lại bằng giấy nhôm để đảm bảo mẫu được giữ trong bóng tối và đặt vào máy ủ ở 35oC cho đậu nảy mầm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các nghiệm thức được bố trí ngẫu nhiên, theo thời gian nảy mầm của hạt đậu: 0, 1, 2, 3, 4, 5 ngày.
Sau khi đậu đã nảy mầm, thu hoạch tất cả rễ, hạt và mầm đậu, chỉ chọn những hạt nảy mầm, loại bỏ các hạt hỏng hoặc không nảy mầm. Bảo quản đậu ở -20o
C trong 24 giờ rồi sấy đông khô. Sau khi sấy xong, nghiền mẫu thành bột mịn và trữ ở 4oC để chuẩn bị cho các thí nghiệm sau.
3.2.3. Phƣơng pháp ly trích polyphenols (Lin và Lai, 2006)
Dùng 5 g bột đã nghiền mịn hòa với 100 mL dung dịch methanol 80%. Sau đó đem đi ủ và lắc ở 60oC trong 2 giờ. Sau khi ủ xong, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman để loại bỏ phần cặn, thu lấy phần dịch trích và bảo quản ở -20 oC.
3.2.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polyphenols toàn phần
Hàm lượng polyphenols trong mẫu được đo thông qua đường chuẩn acid gallic (Taga và cs., 1984). 100 µL dung dịch ly trích mẫu được hòa với 100 µL dung dịch methanol:H2O tỉ lệ 60:40 (0,3% HCl), sau đó cho thêm Na2CO3 2% (2 mL) và để yên trong 2 phút. Tiếp theo, cho vào hỗn hợp phản ứng 100 µL thuốc thử Folin-Ciocalteu, sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Lấy ra và đem hỗn hợp đi vortex trong 2 phút. Sau khi vortex xong, đo độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 750 nm. Nghiệm thức đối chứng là hạt đậu khô, chưa qua quá trình ngâm nước và nảy mầm.
Dựng đường chuẩn acid gallic
Cân 10 mg acid gallic, định mức chính xác đến 10 ml bằng nước cất, được dung dịch có nồng độ 1 mg/mL. Pha loãng tiếp 10 lần được dung dịch có nồng độ 0.1 mg/mL. Từ dung dịch chuẩn này, pha các dung dịch acid gallic với các nồng độ khác nhau là 5 µg/mL, 10 µg/mL, 15 µg/mL, 20 µg/mL, 25 µg/mL. Mẫu đối chứng là mẫu nước cất, không thêm acid gallic.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Tiếp tục thí nghiệm trên. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Bảng 2. Cách dựng đƣờng chuẩn acid gallic
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 Hút từ dung dịch chuẩn (µL) 0 50 100 150 200 250 Thể tích nước cất 1000 950 900 850 800 750 Nồng độ acid gallic (µg/mL) 0 5 10 15 20 25
3.2.5. Đánh giá khả năng chống oxy hóa
Khả năng chống oxy hóa của mẫu được đánh giá thông qua thí nghiệm về khả năng khử, và khả năng cắt các gốc tự do, trong đó có sử dụng 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH).
Đánh giá khả năng khử (Lin và Lai, 2006)
1 mL dung dịch mẫu được hòa tan với 2,5 mL phosphate buffer (pH 6,6) và 2,5 mL K3[Fe(CN)6]1%. Sau đó đem đi ủ ở 50oC trong 20 phút cho hỗn hợp phản ứng. Tiếp đó, cho vào hỗn hợp 2,5 mL trichloroacetic acid 10% và đem ly tâm 3000 rpm trong 10 phút. Phần nổi bên trên (2,5 mL) được hòa với 2,5 mL nước cất và 0,5 mL dung dịch FeCl3 1%. Đo độ hấp thụ bước sóng 700 nm. Công thức tính khả năng khử:
[(ODđối chứng - ODmẫu)/ODđối chứng] x 100%
Mẫu đối chứng là mẫu thay dịch trích đậu bằng nước cất và tiến hành thí nghiệm như trên.
Đánh giá khả năng cắt các gốc tự do (Siddiqua và cs., 2010)
Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống nghiệm 3 mL methanol 100% và 150 µL thuốc thử DPPH 0,1%, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm vào mỗi ống nghiệm 1 mL dịch trích đậu và lắc đều, để yên trong 30 phút cho hỗn hợp phản ứng. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo với bước sóng 519 nm. Khả năng khử gốc tự do của mẫu được tính dựa trên công thức:
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Mẫu đối chứng là mẫu chứa dịch trích đậu chưa nảy mầm (ngày 0) và tiến hành thí nghiệm như trên.
3.2.6. Phân tích trên hệ thống HPLC
Polyphenols toàn phần được lọc bằng màng lọc nylon (0,45 µm) trước khi phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi HPLC apparatus (Hitachi, Tokyo, Japan), hệ thống bao gồm bơm Model L-6200, bộ phận tiêm mẫu Rheodyne Model 7125, bộ phận đọc tín hiệu Model L-4000 UV-Vis (bước sóng 270 nm), bộ phận trích xuất dữ liệu Model D-2500 Chromato-integrator. Cột RP C18 Luna (150 mm x 4,6 nm ID x 5 µm được sử dụng cho phân tách. Quá trình rửa giải bắt đầu với methanol nồng độ tăng dần từ 0-30% trong 50 phút đầu tiên với tốc độ dòng 0,7 mL/phút, sau đó giữ ổn định trong 15 phút tiếp theo. Từ phút 65 đến phút 75, tăng dần nồng độ methanol từ 30% lên 100%. Hai chất chuẩn được sử dụng là gallic acid và ferrulic acid với các nồng độ 10, 50, 100 (µg/mL).
3.2.7. Bố trí thí nghiệm
Tất cả các thí nghiệm đều được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Thí nghiệm 1: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng polyphenols trong quá trình nảy mầm của từng loại hạt đậu.
Mục tiêu: xác định thời điểm các loại đậu có hàm lượng polyphenols cao nhất.
Tiến hành: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Gieo hạt, lấy mẫu theo ngày: 0, 1, 2, 3, 4, 5 ngày. - Trích polyphenols, đo nồng độ.
Thí nghiệm gồm một nhân tố: số ngày nảy mầm. Chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng polyphenols (µg/mL).
Thí nghiệm 2: So sánh hàm lượng polyphenols giữa các loại đậu ở ngày nảy mầm có hàm lượng polyphenols cao nhất.
Mục tiêu: xác định loại đậu có hàm lượng polyphenols cao nhất.
Tiến hành: chọn thời điểm có hàm lượng polyphenols cao nhất của từng loại đậu, so sánh nồng độ polyphenols giữa các loại đậu.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Thí nghiệm gồm một nhân tố: polyphenols của từng loại đậu. Chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng polyphenols (µg/mL).
Thí nghiệm 3: So sánh hoạt tính chống oxy hóa của polyphenols trong các loại hạt đậu.
Điều chỉnh hàm lượng polyphenols đã ly trích và xác định nồng độ ở thí nghiệm 1 cho bằng nhau giữa các loại hạt đậu, xác định hoạt tính chống oxy hóa.
Thí nghiệm có một nhân tố: polyphenols của từng loại đậu. Chỉ tiêu đánh giá: % các chất oxy hóa bị khử.
Thí nghiệm 4: Khảo sát thành phần polyphenols trong từng loại hạt đậu.
Lấy mẫu có hàm lượng polyphenols cao nhất ở mỗi thời điểm của từng loại hạt để phân tích bằng hệ thống HPLC.
Thí nghiệm có một nhân tố: polyphenols của từng loại đậu.
3.2.8. Xử lý số liệu
Các số liệu được biểu diễn bằng số liệu trung bình ± độ lệch chuẩn, xử lý thống kê bằng phần mềm Excel và Statgraphics XV. Dùng phép thử LSD để xác định khác biệt có ý nghĩa cho các số liệu (p<0,05).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định hàm lƣợng polyphenols toàn phần
4.1.1. Hàm lƣợng polyphenols toàn phần
Phương pháp Folin-Ciocalteu là một trong những phương pháp được sử dụng để định lượng polyphenols toàn phần. Polyphenols phản ứng với thuốc thử Folin- Ciocalteu (dung dịch màu vàng của phosphotungstenate và molybdate) trong môi trường kiềm yếu tạo thành màu xanh dương, hấp thụ ở bước sóng 750 nm. Lượng polyphenols toàn phần được tính dựa vào độ hấp thụ của mẫu hợp chất và đường chuẩn acid gallic. Kết quả định lượng của polyphenols toàn phần được quy về acid gallic.
Hình 4. Hàm lƣợng polyphenols của các loại đậu
(Những cột trong cùng một nhóm có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05)).
Hàm lượng polyphenols trong đậu xanh có sự tăng lên theo thời gian nảy mầm (Hình 5). Cụ thể, hàm lượng polyphenols tăng dần từ ngày 0 (hạt chưa qua quá trình ngâm và nảy mầm) đến ngày 5, ngày 5 là ngày có hàm lượng polyphenols cao nhất trong các ngày khảo sát. Từ ngày 0 đến ngày thứ 4, hàm lượng polyphenols trong hạt
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
tăng dần nhưng không đều. Đến ngày thứ 5, hàm lượng polyphenols có sự tăng đột biến, từ 6,28 lên 7,5 µg/mL (tương đương acid gallic). Điều này có thể do sự tăng cường trao đổi chất mạnh đột ngột trong hạt dẫn đến hàm lượng polyphenols tăng đột biến.
Ở đậu đen, có thể nhận thấy rõ sự thay đổi về hàm lượng polyphenols từ lúc hạt chưa nảy mầm (ngày 0) đến khi nảy mầm ngày thứ 1. Do sự trao đổi chất bên trong hạt khi bắt đầu có sự hiện diện của nước, các hợp chất bên trong hạt biến đổi, tạo ra nhiều năng lượng và nhiều hợp chất mới, trong đó có sự gia tăng hàm lượng polyphenols, ở đậu đen, có lẽ quá trình này diễn ra mạnh mẽ hơn đậu xanh. Từ ngày nảy mầm thứ 2 đến ngày thứ 4, hàm lượng polyphenols tiếp tục tăng nhưng không đáng kể, riêng từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 4, không có sự chênh lệch đáng kể. Nguyên nhân có thể do chiều dài mầm trong hai ngày này không có sự khác biệt quá lớn khi quan sát bằng mắt thường. Mà đối với đậu, sự trao đổi chất bên trong và chiều dài mầm có sự liên hệ chặt chẽ, sự khác biệt nhỏ về chiều dài mầm cũng đồng nghĩa với việc sự trao đổi chất cũng diễn ra chậm đi phần nào. Sang ngày thứ 5, hàm lượng polyphenols lại tăng nhanh chóng. Ngày 5 cũng là ngày hàm lượng polyphenols đạt cao nhất trong các ngày khảo sát với 8,23 µg/mL (tương đương acid gallic).
Tương tự như ở đậu đen, hàm lượng polyphenols trong đậu phộng từ lúc hạt chưa nảy mầm đến khi nảy mầm ngày thứ nhất có sự gia tăng tương đối nhanh do sự trao đổi chất bên trong hạt được tăng cường, từ 9,07 µg/mL tăng lên 13,29 µg/mL (tương đương acid gallic). Các ngày sau đó, hàm lượng polyphenols tăng dần đều qua từng ngày nhưng không có sự khác biệt đáng kể. Sự trao đổi chất trong hạt đậu diễn ra chậm, tạo ra thêm ít polyphenols nên sự chênh lệch về hàm lượng polyphenols từ ngày 1 đến ngày 4 là không nhiều. Đến ngày thứ 5, có sự tăng hàm lượng polyphenols đáng kể, từ 14,97 µg/mL lên 18,50 µg/mL (tương đương acid gallic). Về mặt thống kê, sự khác biệt về hàm lượng polyphenols giữa các ngày đều có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Dựa vào biểu đồ, có thể thấy được hàm lượng polyphenols ở đậu đỏ tăng nhẹ qua từng ngày, không có sự chuyển biến lớn về hàm lượng polyphenols trong hai ngày lien tiếp. Ngày thứ 5 vẫn là ngày có hàm lượng polyphenols cao nhất với nồng độ 8,47 µg/mL (tương đương acid gallic). Điều này có thể lý giải được vì sự trao đổi chất ở đậu đỏ trong suốt thời kỳ nảy mầm diễn ra tương đối chậm. Quan sát bằng mắt thường
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
từ lúc bắt đầu gieo hạt đến ngày nảy mầm thứ 5, sự khác biệt về chiều dài mầm là rất nhỏ.
Được biết đến như nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sức khỏe, đậu nành có chứa hàm lượng các chất chống oxy hóa cao. Có thể dễ dàng nhận thấy hàm lượng polyphenols từ lúc hạt chưa nảy mầm đến khi nảy mầm ngày thứ nhất có sự thay đổi khá lớn, từ 7,01 µg/mL tăng lên 10,65 µg/mL (tương đương acid gallic). Sang ngày thứ 2, xu thế tăng có phần chững lại đôi chút khi hàm lượng polyphenols chỉ tăng chút ít, từ 10,65 µg/mL lên 10,73 µg/mL (tương đương acid gallic). Các ngày sau đó, hàm lượng polyphenols tăng nhẹ qua từng ngày và đạt cao nhất ở ngày thứ 5 (13,97 µg/mL, tương đương acid gallic).
Ở đậu trắng, có thể nhận thấy một xu thế chung, hàm lượng polyphenols tương đối đều qua từng ngày nảy mầm, mặc dù từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 3, hàm lượng polyphenols có tăng chậm đôi chút so với những ngày khác. Tuy hàm lượng polyphenols trong đậu trắng ít hơn đậu nành và đậu phộng, nhưng có thể thấy sự thay đổi hàm lượng polyphenols qua từng ngày là rất đáng kể, có sự khác biệt lớn so với 5 loại đậu còn lại. Quá trình nảy mầm, trao đổi và tổng hợp chất diễn ra đều đặn, không (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});