2.5.1. Các giai đoạn của sự nảy mầm
Hạt nảy mầm trải qua 5 giai đoạn sau:
Sự hóa nước (trương nước)
Hình thành và hoạt hóa enzyme
Động viên chất dự trữ
Phôi bắt đầu sinh trưởng, tách vỏ hạt
Sinh trưởng tiếp tục của cây mầm a) Sự trương nước của hạt
Giai đoạn 1: Nhờ lực hóa nước của các hạt keo trong hạt (sức trương), các phân tử nước bao quanh hạt keo được hóa nước và được giữ với một lực lớn. Trong khi hạt keo hút nước trương lên thì xuất hiện một áp suất. Yếu tố nhiệt độ có vai trò quan trọng trong giai đoạn này.
Giai đoạn 2: Lực trương vẫn giữ vai trò chủ yếu, song lực thẩm thấu đang lớn dần do các hợp chất phức tạp bị thủy phân thành các hợp chất đơn giản, dễ hòa tan.
Giai đoạn 3: Các tế bào kéo dài và bắt đầu xuất hiện không bào, lực thẩm thấu đóng vai trò chủ yếu.
b) Giai đoạn hình thành và hoạt hóa enzyme
Trong phôi và nội nhũ của hạt ở trạng thái ngủ, enzyme thường ở dạng bất hoạt và bị liên kết. Dưới ảnh hưởng của quá trình trương, enzyme chuyển thành dạng hoạt tính, đồng thời có quá trình tổng hợp mới một số enzyme. Quá trình này cần có mARN tương ứng, có 3 loại mARN là:
mARN tiềm sinh
mARN được phiên mã từ giai đoạn phát sinh phôi, nhưng chưa có hoạt tính
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Thoạt đầu, sự tổng hợp protein ở các ribosome có sẵn ở phôi, sau khoảng 8 giờ từ khi ngấm nước thì ribosome mới được hình thành và gia tăng. Các enzyme cần thiết trước hết là enzyme xúc tác quá trình phân giải carbohydrate β-amylase thường ở dạng liên kết trong hạt khô, còn α–amylase được tổng hợp mới. Các enzyme phân giải protide và lipid cũng được tạo mới.
Vấn đề tích lũy năng lượng:
Sau khi hạt hút nước thì cường độ hấp thu oxy cũng tăng lên. Cường độ quá trình oxy hóa theo chu trình pentophosphate tăng mạnh, tích lũy ATP. Sau 4 giờ, ATP tăng lên 20 lần, cung cấp cho các quá trình tổng hợp protein-enzyme.
Sau 10-12 giờ, các ty thể mới lớn và phân hóa nhanh chóng. Sau 24 giờ, ty thể phân chia làm tăng số lượng, chức năng, quá trình oxy hóa theo chu trình Krebs tăng cường. Đây là nguồn cung cấp năng lượng cho cây mầm. c) Giai đoạn động viên chất dinh dưỡng và xây dựng thành phần của các cơ quan phôi đang lớn
Các hợp chất lipid có nhiều trong nội nhũ, lá mầm và trụ phôi. Glucide (tinh bột) Phân giải Monosaccharide
(disaccharide)
ATP Hô hấp
Các tế bào tạo phôi Vận chuyển
Acid béo Oxy hóa Acetyl CoA
Chu trình
glyoxylic Acid
sucxilic Ti thể
APEP Phản ứng ngược chiều đường phân
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Trong hạt:
Nucleic acid một phần bị phân giải bởi enzyme nuclease thành các nucleotides và được chuyển vào trụ phôi.
Các hợp chất đơn giản hơn do phân giải được chuyển vào trụ phôi. Tại đây, một phần được dùng làm nguyên liệu hô hấp, một phần dùng để xây dựng các cấu trúc mới của tế bào.
Các phytohormone cũng được tạo ra ở pha nảy mầm như auxin và cytokinin, còn gibberellin được giải phóng thành dạng tự do, kích thích sự tổng hợp các enzyme thủy phân.
Sự phân giải nucleic acid thành các base purine là tiền chất của cytokinin. Còn tryptophan do phân giải protide là tiền chất của auxin.
d) Sự phân giải của phôi
Phôi được tạo thành từ hợp tử. Trong nhiều loại hạt phôi ở dạng ngủ đã có lá mầm và trụ dưới lá mầm. Tế bào của phôi đã có sự phân hóa thành biểu bì, bó mạch và các tế bào dự trữ. Mầm cành ở giữa hai lá mầm và mầm rễ ở đầu gốc của trụ dưới lá mầm còn bé và nằm yên lặng trong hạt cho đến khi nảy mầm.
Khi nảy mầm, phôi sinh trưởng, các tế bào rễ nhú ra trước tiên để hút nước, chất dinh dưỡng và cố định cây mầm. Trụ dưới lá mầm duỗi ra, sau đó mầm cành mới sinh trưởng tạo thành cành.
Sự khởi đầu của các quá trình sinh trưởng là nhờ pha kéo dài tế bào. Trong tế bào bắt đầu xuất hiện không bào, nhờ đó thể thẩm thấu xuất hiện và lớn dần.
Protease Acid amin
Vận chuyển Trụ phôi Acid hữu cơ
Tổng hợp Protein Tồn tại Hạt aleurone Thể protein Amoniac Tổng hợp
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Sự sinh trưởng tiếp của cây mầm
Căn cứ vào sự sinh trưởng của cây mầm ở những giai đoạn đầu thì người ta phân biệt hai kiểu sinh trưởng:
Kiểu sinh trưởng dưới mặt đất: đậu Hà Lan, hòa thảo: lá mầm nằm lại dưới mặt đất.
Kiểu sinh trưởng trên mặt đất: đậu đỗ, hành: lá mầm được đẩy lên trên mặt đất.
2.5.2. Sự thay đổi hàm lƣợng các chất chống oxy hóa
Ở đậu, hợp chất polyphenols bao gồm những chất chống oxy hóa quan trọng nhất như phenolic acids, flavonoids. Những chất này tồn tại như những ester tự do hòa tan đơn giản, và ở quy mô rộng hơn,chúng tồn tại như phức hợp những ester bám không hòa tan như polysaccharides, proteins, hoặc màng tế bào của hạt đậu. Thành phần và hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất polyphenols bị ảnh hưởng nhiều bởi cách bảo quản, nhiệt, và một số quy trình chế biến, chúng có thể làm giảm hàm lượng polyphenols trong đậu. Để đảm bảo hoặc cải thiện giá trị dinh dưỡng và chức năng của đậu, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự nảy mầm của hạt có thể làm tăng hàm lượng polyphenols và hoạt tính chống oxy hóa. Sự nảy mầm bắt đầu từ việc ngâm nước, những hạt đậu khô sẽ hấp thu nước đến khi đạt độ ẩm khoảng 43-45%, và hoạt động trao đổi chất bắt đầu trở lại. Trong suốt quá trình nảy mầm diễn ra sau đó, sự tổng hợp enzyme và sự biến đổi trong nhân bắt đầu xảy ra, điều đó có thể làm tăng hàm lượng polyphenols bên trong và hoạt tính chống oxy hóa.
2.6. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 2.6.1. Giới thiệu 2.6.1. Giới thiệu
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do: có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh vực khác.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hợp chất có thể phân tích bằng sắc ký lỏng như acid amin, protein, acid nucleic, hydrocacbon, carbohydrate, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu, các hợp chất vô cơ… Dựa vào sự khác nhau về cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà người ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến. Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng pha thường và sắc ký lỏng pha đảo.
-Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động, dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.
-Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký pha thường, pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn. Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa. Dung môi sử dụng là dung môi phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền, do đó sắc ký lỏng pha đảo được sử dụng nhiều nhất.
2.6.2. Các bộ phận của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính: bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký phân tích, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu.
Mẫu sau khi được tiêm vào cột sẽ được pha động lôi kéo qua cột. Dựa vào khả năng tương tác khác nhau giữa các chất có trong nền mẫu với pha tĩnh và pha động mà chúng được tách ra khỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi bộ dò cụ thể. Sắc ký lỏng có thể ghép với nhiều loại đầu dò khác nhau như đầu dò phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis, đầu dò huỳnh quang FLD, đầu dò chỉ số khúc xạ RID, đầu dò điện hóa ECD, đầu dò khối phổ MS… Hiện nay đầu dò khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong phân tích vết và các hợp chất nhận danh chính xác.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu:
Các loại đậu: đậu xanh, đậu trắng, đậu đen, đậu đỏ, đậu nành, đậu phộng được mua từ chợ Xuân Khánh.
- Đậu xanh (Vigna radiata)
- Đậu trắng (Vigna unguiculata)
- Đậu đen (Vigna cylindrica)
- Đậu đỏ (Vigna angularis)
- Đậu nành (Glycine max)
- Đậu phộng (Arachis hypogaea)
Loại bỏ những hạt bị sâu và các tạp chất lẫn trong đậu nếu có.
3.1.2. Hóa chất:
Methanol, NaOH, HCl, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), thuốc thử Folin- Ciocalteu, Na2CO3, FeCl3, phosphate buffer (pH 6,6), K3Fe(CN)6, trichloroacetic acid (TCA) và các hóa chất khác.
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ:
Thiết bị: tủ lạnh (SANYO – Nhật), tủ đông (SANAKY – Nhật), cân điện tử (Adventure – M ), máy đo quang phổ U-1500 (Hitachi – Nhật), máy khuấy từ (Heidolph – Đức), máy ủ lắc (Eppendorf – Đức), và một số thiết bị khác.
Dụng cụ: bình tam giác, ống nghiệm, micropipette, và một số dụng cụ khác.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu:
Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm công nghệ enzyme, viện NC&PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.2.2. Chuẩn bị hạt nảy mầm
Ngâm đậu với nước ở 35oC trong 5 giờ, sau đó rút hết nước. Rải đều đậu vào hộp nhựa có lót sẵn vải mềm. Bọc hộp lại bằng giấy nhôm để đảm bảo mẫu được giữ trong bóng tối và đặt vào máy ủ ở 35oC cho đậu nảy mầm.
Các nghiệm thức được bố trí ngẫu nhiên, theo thời gian nảy mầm của hạt đậu: 0, 1, 2, 3, 4, 5 ngày.
Sau khi đậu đã nảy mầm, thu hoạch tất cả rễ, hạt và mầm đậu, chỉ chọn những hạt nảy mầm, loại bỏ các hạt hỏng hoặc không nảy mầm. Bảo quản đậu ở -20o
C trong 24 giờ rồi sấy đông khô. Sau khi sấy xong, nghiền mẫu thành bột mịn và trữ ở 4oC để chuẩn bị cho các thí nghiệm sau.
3.2.3. Phƣơng pháp ly trích polyphenols (Lin và Lai, 2006)
Dùng 5 g bột đã nghiền mịn hòa với 100 mL dung dịch methanol 80%. Sau đó đem đi ủ và lắc ở 60oC trong 2 giờ. Sau khi ủ xong, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman để loại bỏ phần cặn, thu lấy phần dịch trích và bảo quản ở -20 oC.
3.2.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polyphenols toàn phần
Hàm lượng polyphenols trong mẫu được đo thông qua đường chuẩn acid gallic (Taga và cs., 1984). 100 µL dung dịch ly trích mẫu được hòa với 100 µL dung dịch methanol:H2O tỉ lệ 60:40 (0,3% HCl), sau đó cho thêm Na2CO3 2% (2 mL) và để yên trong 2 phút. Tiếp theo, cho vào hỗn hợp phản ứng 100 µL thuốc thử Folin-Ciocalteu, sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Lấy ra và đem hỗn hợp đi vortex trong 2 phút. Sau khi vortex xong, đo độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 750 nm. Nghiệm thức đối chứng là hạt đậu khô, chưa qua quá trình ngâm nước và nảy mầm.
Dựng đường chuẩn acid gallic
Cân 10 mg acid gallic, định mức chính xác đến 10 ml bằng nước cất, được dung dịch có nồng độ 1 mg/mL. Pha loãng tiếp 10 lần được dung dịch có nồng độ 0.1 mg/mL. Từ dung dịch chuẩn này, pha các dung dịch acid gallic với các nồng độ khác nhau là 5 µg/mL, 10 µg/mL, 15 µg/mL, 20 µg/mL, 25 µg/mL. Mẫu đối chứng là mẫu nước cất, không thêm acid gallic.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Tiếp tục thí nghiệm trên. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Bảng 2. Cách dựng đƣờng chuẩn acid gallic
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 Hút từ dung dịch chuẩn (µL) 0 50 100 150 200 250 Thể tích nước cất 1000 950 900 850 800 750 Nồng độ acid gallic (µg/mL) 0 5 10 15 20 25
3.2.5. Đánh giá khả năng chống oxy hóa
Khả năng chống oxy hóa của mẫu được đánh giá thông qua thí nghiệm về khả năng khử, và khả năng cắt các gốc tự do, trong đó có sử dụng 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH).
Đánh giá khả năng khử (Lin và Lai, 2006)
1 mL dung dịch mẫu được hòa tan với 2,5 mL phosphate buffer (pH 6,6) và 2,5 mL K3[Fe(CN)6]1%. Sau đó đem đi ủ ở 50oC trong 20 phút cho hỗn hợp phản ứng. Tiếp đó, cho vào hỗn hợp 2,5 mL trichloroacetic acid 10% và đem ly tâm 3000 rpm trong 10 phút. Phần nổi bên trên (2,5 mL) được hòa với 2,5 mL nước cất và 0,5 mL dung dịch FeCl3 1%. Đo độ hấp thụ bước sóng 700 nm. Công thức tính khả năng khử:
[(ODđối chứng - ODmẫu)/ODđối chứng] x 100%
Mẫu đối chứng là mẫu thay dịch trích đậu bằng nước cất và tiến hành thí nghiệm như trên.
Đánh giá khả năng cắt các gốc tự do (Siddiqua và cs., 2010)
Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống nghiệm 3 mL methanol 100% và 150 µL thuốc thử DPPH 0,1%, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm vào mỗi ống nghiệm 1 mL dịch trích đậu và lắc đều, để yên trong 30 phút cho hỗn hợp phản ứng. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo với bước sóng 519 nm. Khả năng khử gốc tự do của mẫu được tính dựa trên công thức:
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Mẫu đối chứng là mẫu chứa dịch trích đậu chưa nảy mầm (ngày 0) và tiến hành thí nghiệm như trên.
3.2.6. Phân tích trên hệ thống HPLC
Polyphenols toàn phần được lọc bằng màng lọc nylon (0,45 µm) trước khi phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi HPLC apparatus (Hitachi, Tokyo, Japan), hệ thống bao gồm bơm Model L-6200, bộ phận tiêm mẫu Rheodyne Model 7125, bộ phận đọc tín hiệu Model L-4000 UV-Vis (bước sóng 270 nm), bộ phận trích xuất dữ liệu Model D-2500 Chromato-integrator. Cột RP C18 Luna (150 mm x 4,6 nm ID x 5 µm được sử dụng cho phân tách. Quá trình rửa giải bắt đầu với methanol nồng độ tăng dần từ 0-30% trong 50 phút đầu tiên với tốc độ dòng 0,7 mL/phút, sau đó giữ ổn định trong 15 phút tiếp theo. Từ phút 65 đến phút 75, tăng dần nồng độ methanol từ 30% lên 100%. Hai chất chuẩn được sử dụng là gallic acid và ferrulic acid với các nồng độ 10, 50, 100 (µg/mL).
3.2.7. Bố trí thí nghiệm
Tất cả các thí nghiệm đều được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Thí nghiệm 1: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng polyphenols trong quá trình nảy mầm của từng loại hạt đậu.
Mục tiêu: xác định thời điểm các loại đậu có hàm lượng polyphenols cao nhất.
Tiến hành:
- Gieo hạt, lấy mẫu theo ngày: 0, 1, 2, 3, 4, 5 ngày. - Trích polyphenols, đo nồng độ.
Thí nghiệm gồm một nhân tố: số ngày nảy mầm. Chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng polyphenols (µg/mL).
Thí nghiệm 2: So sánh hàm lượng polyphenols giữa các loại đậu ở ngày nảy mầm có hàm lượng polyphenols cao nhất.
Mục tiêu: xác định loại đậu có hàm lượng polyphenols cao nhất.
Tiến hành: chọn thời điểm có hàm lượng polyphenols cao nhất của từng loại đậu, so sánh nồng độ polyphenols giữa các loại đậu.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Thí nghiệm gồm một nhân tố: polyphenols của từng loại đậu.