Bố trí thí nghiệm - khảo sát hoạt tính chống oxy h- 123docz.net

Tất cả các thí nghiệm đều được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.

 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng polyphenols trong quá trình nảy mầm của từng loại hạt đậu.

Mục tiêu: xác định thời điểm các loại đậu có hàm lượng polyphenols cao nhất.

Tiến hành:

- Gieo hạt, lấy mẫu theo ngày: 0, 1, 2, 3, 4, 5 ngày. - Trích polyphenols, đo nồng độ.

Thí nghiệm gồm một nhân tố: số ngày nảy mầm. Chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng polyphenols (µg/mL).

 Thí nghiệm 2: So sánh hàm lượng polyphenols giữa các loại đậu ở ngày nảy mầm có hàm lượng polyphenols cao nhất.

Mục tiêu: xác định loại đậu có hàm lượng polyphenols cao nhất.

Tiến hành: chọn thời điểm có hàm lượng polyphenols cao nhất của từng loại đậu, so sánh nồng độ polyphenols giữa các loại đậu.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Thí nghiệm gồm một nhân tố: polyphenols của từng loại đậu. Chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng polyphenols (µg/mL).

 Thí nghiệm 3: So sánh hoạt tính chống oxy hóa của polyphenols trong các loại hạt đậu.

Điều chỉnh hàm lượng polyphenols đã ly trích và xác định nồng độ ở thí nghiệm 1 cho bằng nhau giữa các loại hạt đậu, xác định hoạt tính chống oxy hóa.

Thí nghiệm có một nhân tố: polyphenols của từng loại đậu. Chỉ tiêu đánh giá: % các chất oxy hóa bị khử.

 Thí nghiệm 4: Khảo sát thành phần polyphenols trong từng loại hạt đậu.

Lấy mẫu có hàm lượng polyphenols cao nhất ở mỗi thời điểm của từng loại hạt để phân tích bằng hệ thống HPLC.

Thí nghiệm có một nhân tố: polyphenols của từng loại đậu.

3.2.8. Xử lý số liệu

Các số liệu được biểu diễn bằng số liệu trung bình ± độ lệch chuẩn, xử lý thống kê bằng phần mềm Excel và Statgraphics XV. Dùng phép thử LSD để xác định khác biệt có ý nghĩa cho các số liệu (p<0,05).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định hàm lƣợng polyphenols toàn phần

4.1.1. Hàm lƣợng polyphenols toàn phần

Phương pháp Folin-Ciocalteu là một trong những phương pháp được sử dụng để định lượng polyphenols toàn phần. Polyphenols phản ứng với thuốc thử Folin- Ciocalteu (dung dịch màu vàng của phosphotungstenate và molybdate) trong môi trường kiềm yếu tạo thành màu xanh dương, hấp thụ ở bước sóng 750 nm. Lượng polyphenols toàn phần được tính dựa vào độ hấp thụ của mẫu hợp chất và đường chuẩn acid gallic. Kết quả định lượng của polyphenols toàn phần được quy về acid gallic.

Hình 4. Hàm lƣợng polyphenols của các loại đậu

(Những cột trong cùng một nhóm có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05)).

Hàm lượng polyphenols trong đậu xanh có sự tăng lên theo thời gian nảy mầm (Hình 5). Cụ thể, hàm lượng polyphenols tăng dần từ ngày 0 (hạt chưa qua quá trình ngâm và nảy mầm) đến ngày 5, ngày 5 là ngày có hàm lượng polyphenols cao nhất trong các ngày khảo sát. Từ ngày 0 đến ngày thứ 4, hàm lượng polyphenols trong hạt

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

tăng dần nhưng không đều. Đến ngày thứ 5, hàm lượng polyphenols có sự tăng đột biến, từ 6,28 lên 7,5 µg/mL (tương đương acid gallic). Điều này có thể do sự tăng cường trao đổi chất mạnh đột ngột trong hạt dẫn đến hàm lượng polyphenols tăng đột biến.

Ở đậu đen, có thể nhận thấy rõ sự thay đổi về hàm lượng polyphenols từ lúc hạt chưa nảy mầm (ngày 0) đến khi nảy mầm ngày thứ 1. Do sự trao đổi chất bên trong hạt khi bắt đầu có sự hiện diện của nước, các hợp chất bên trong hạt biến đổi, tạo ra nhiều năng lượng và nhiều hợp chất mới, trong đó có sự gia tăng hàm lượng polyphenols, ở đậu đen, có lẽ quá trình này diễn ra mạnh mẽ hơn đậu xanh. Từ ngày nảy mầm thứ 2 đến ngày thứ 4, hàm lượng polyphenols tiếp tục tăng nhưng không đáng kể, riêng từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 4, không có sự chênh lệch đáng kể. Nguyên nhân có thể do chiều dài mầm trong hai ngày này không có sự khác biệt quá lớn khi quan sát bằng mắt thường. Mà đối với đậu, sự trao đổi chất bên trong và chiều dài mầm có sự liên hệ chặt chẽ, sự khác biệt nhỏ về chiều dài mầm cũng đồng nghĩa với việc sự trao đổi chất cũng diễn ra chậm đi phần nào. Sang ngày thứ 5, hàm lượng polyphenols lại tăng nhanh chóng. Ngày 5 cũng là ngày hàm lượng polyphenols đạt cao nhất trong các ngày khảo sát với 8,23 µg/mL (tương đương acid gallic).

Tương tự như ở đậu đen, hàm lượng polyphenols trong đậu phộng từ lúc hạt chưa nảy mầm đến khi nảy mầm ngày thứ nhất có sự gia tăng tương đối nhanh do sự trao đổi chất bên trong hạt được tăng cường, từ 9,07 µg/mL tăng lên 13,29 µg/mL (tương đương acid gallic). Các ngày sau đó, hàm lượng polyphenols tăng dần đều qua từng ngày nhưng không có sự khác biệt đáng kể. Sự trao đổi chất trong hạt đậu diễn ra chậm, tạo ra thêm ít polyphenols nên sự chênh lệch về hàm lượng polyphenols từ ngày 1 đến ngày 4 là không nhiều. Đến ngày thứ 5, có sự tăng hàm lượng polyphenols đáng kể, từ 14,97 µg/mL lên 18,50 µg/mL (tương đương acid gallic). Về mặt thống kê, sự khác biệt về hàm lượng polyphenols giữa các ngày đều có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Dựa vào biểu đồ, có thể thấy được hàm lượng polyphenols ở đậu đỏ tăng nhẹ qua từng ngày, không có sự chuyển biến lớn về hàm lượng polyphenols trong hai ngày lien tiếp. Ngày thứ 5 vẫn là ngày có hàm lượng polyphenols cao nhất với nồng độ 8,47 µg/mL (tương đương acid gallic). Điều này có thể lý giải được vì sự trao đổi chất ở đậu đỏ trong suốt thời kỳ nảy mầm diễn ra tương đối chậm. Quan sát bằng mắt thường

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

từ lúc bắt đầu gieo hạt đến ngày nảy mầm thứ 5, sự khác biệt về chiều dài mầm là rất nhỏ.

Được biết đến như nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sức khỏe, đậu nành có chứa hàm lượng các chất chống oxy hóa cao. Có thể dễ dàng nhận thấy hàm lượng polyphenols từ lúc hạt chưa nảy mầm đến khi nảy mầm ngày thứ nhất có sự thay đổi khá lớn, từ 7,01 µg/mL tăng lên 10,65 µg/mL (tương đương acid gallic). Sang ngày thứ 2, xu thế tăng có phần chững lại đôi chút khi hàm lượng polyphenols chỉ tăng chút ít, từ 10,65 µg/mL lên 10,73 µg/mL (tương đương acid gallic). Các ngày sau đó, hàm lượng polyphenols tăng nhẹ qua từng ngày và đạt cao nhất ở ngày thứ 5 (13,97 µg/mL, tương đương acid gallic).

Ở đậu trắng, có thể nhận thấy một xu thế chung, hàm lượng polyphenols tương đối đều qua từng ngày nảy mầm, mặc dù từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 3, hàm lượng polyphenols có tăng chậm đôi chút so với những ngày khác. Tuy hàm lượng polyphenols trong đậu trắng ít hơn đậu nành và đậu phộng, nhưng có thể thấy sự thay đổi hàm lượng polyphenols qua từng ngày là rất đáng kể, có sự khác biệt lớn so với 5 loại đậu còn lại. Quá trình nảy mầm, trao đổi và tổng hợp chất diễn ra đều đặn, không có thời điểm nào quá nhanh, cũng không có thời điểm nào quá chậm.

4.1.2. So sánh hàm lƣợng polyphenols giữa các loại đậu ở ngày nảy mầm thứ năm.

Từ thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenols qua 5 ngày nảy mầm của các loại đậu, có thể nhận thấy hàm lượng polyphenols tăng dần theo thời gian nảy mầm và đạt cao nhất ở ngày thứ 5. Do đó, để xác định loại đậu nào có hàm lượng polyphenols cao nhất, các nghiệm thức ngày nảy mầm thứ 5 của các loại đậu đã được chọn ra để so sánh với nhau về hàm lượng polyphenols toàn phần.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 5. Hàm lƣợng polyphenols trong 6 loại đậu ở ngày nảy mầm thứ 5

(Những cột có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05)).

Quan sát biểu đồ hình 11 có thể kết luận đậu phộng là loại đậu có chứa hàm lượng polyphenols cao nhất trong 6 loại đậu được khảo sát. Trong quá trình nảy mầm của đậu phộng, resveratrol được tổng hợp với hàm lượng lớn. Resveratrol chính là một loại polyphenols hiện diện rất nhiều trong đậu phộng, nhất là khi đậu phộng nảy mầm (Win và cs., 2011). Bên cạnh đó, flavonoids và epicatechin cũng là hai loại polyphenols có rất nhiều trong đậu phộng (Francisco và Resurreccion, 2009). Còn ở đậu nành, polyphenols chủ yếu chính là flavonoids trong khi ở đậu xanh, đậu đỏ, đậu đen và đậu trắng, thành phần chủ yếu gồm phenolic acids (Sosulski và cs., 1982). Một số nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenols được ly trích phụ thuộc vào dung môi được sử dụng và thành phần polyphenols trong các mẫu. Theo Nepote (2005), dung môi methanol phù hợp để ly trích các mẫu có chứa resveratrol và stilbenes. Đối với phenolic acids, để việc ly trích đạt hàm lượng cao, dung môi thường được sử dụng là ethanol (Sosulski, 1982). Vì những lý do trên, kết quả thí nghiệm này thu được hàm lượng polyphenols toàn phần của đậu phộng cao hơn các loại đậu khác là một kết quả phù hợp.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

4.2. Đánh giá khả năng chống oxy hóa

Lấy mẫu có hàm lượng polyphenols cao nhất ở mỗi thời điểm của từng loại hạt, điều chỉnh hàm lượng polyphenols đã ly trích và xác định nồng độ ở thí nghiệm 1 cho bằng nhau giữa các loại hạt đậu. Cụ thể, điều chỉnh nồng độ dung dịch ly trích của các loại đậu ngày nảy mầm thứ 5 đều là 5 µg/mL.

4.2.1. Đánh giá khả năng khử

Khi có sự hiện diện của chất chống oxy hóa, ion Fe3+ bị khử thành ion Fe2+. Sau đó, ion Fe2+ làm cho dung dịch phản ứng có màu xanh thẫm, hấp thụ bước sóng 700 nm.

3Fe2+ + 2K3[Fe(CN)6] → Fe3[Fe(CN)6]2 + 6K+

Tùy vào độ mạnh yếu của hoạt tính chống oxy hóa của polyphenols mà màu sắc dung dịch thu được sau phản ứng có độ đậm nhạt khác nhau. Hoạt tính càng mạnh, dung dịch thu được có độ hấp thụ bước sóng 700 nm càng cao.

Bảng 3. Khả năng khử ion Fe3+ của polyphenols các loại đậu

Loại đậu Khả năng khử Fe3+

(%) Đậu đỏ 64,92 ± 0,57c Đậu xanh 61,53 ± 0,68d Đậu đen 26,45 ± 0,95f Đậu trắng 42,51 ± 1,24e Đậu nành 75,08 ± 1,18b Đậu phộng 84,48 ± 1,24a

Từ bảng kết quả trên cho thấy đậu phộng có khả năng khử ion Fe3+

cao nhất, lên đến 84,48%. Kế đến là đậu nành với 75,08%, và cuối cùng là đậu đen (26,45%).

4.2.2. Đánh giá khả năng cắt gốc tự do

Phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là phương pháp được sử dụng rộng rãi để xác định hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất polyphenols và những dịch trích thực vật có nguồn gốc tự nhiên khác. DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là chất mang các gốc tự do bền vững, có thể bị làm phai màu khi có sự hiện diện của các chất chống oxy hóa. Gốc tự do của DPPH mang một electron lẻ, chính electron

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

này làm cho dung dịch có khả năng hấp thụ bước sóng 519 nm, và dung dịch có màu tím đậm. Khi DPPH nhận một electron góp bởi hợp chất chống oxy hóa, DPPH bị phai màu, sự thay đổi ấy được thể hiện ở sự thay đổi độ hấp thụ bước sóng 519 nm.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Sau khi phản ứng xong, các dung dịch trong các ống nghiệm có sự thay đổi về màu sắc như hình sau:

Hình 6. Sự thay đổi về màu sắc các ống nghiệm sau phản ứng

Khi cho DPPH và dịch trích polyphenols vào cùng một ống nghiệm, các gốc tự do của DPPH bị cắt bởi polyphenols trong dịch trích, dẫn đến màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, kéo theo đó là sự thay đổi về độ hấp thụ ánh sáng khả kiến ở bước sóng 519 nm.

Đây là bảng số liệu thể hiện khả năng cắt gốc tự do DPPH của từng loại đậu:

Bảng 4. Hoạt động cắt gốc tự do của polyphenols trong 6 loại đậu lúc chƣa nảy mầm

Loại đậu % gốc tự do DPPH bị cắt bởi polyphenols

Đậu đen 2,87 ± 0,65f Đậu trắng 5,10 ± 0,51e Đậu xanh 2,12 ± 0,44d Đậu đỏ 2,91 ± 0,7c Đậu nành 7,58 ± 0,76b Đậu phộng 9,77 ± 0,63a

*Các số liệu được biểu diễn bằng trung bình của ba lần lặp. Những số trong cùng một cột có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Bảng 5. Hoạt động cắt gốc tự do của polyphenols trong 6 loại đậu ở ngày nảy mầm thứ 5

Loại đậu % gốc tự do DPPH bị cắt bởi polyphenols

Đậu đen 7,44 ± 0,39f Đậu trắng 11,17 ± 0,63e Đậu xanh 17,46 ± 0,60d Đậu đỏ 20,80 ± 0,39c Đậu nành 26,94 ± 0,71b Đậu phộng 32,51 ± 0,54a

Qua kết quả cho thấy polyphenols trong 6 loại đậu được khảo sát đã có hoạt tính chống oxy hóa với các mức độ khác nhau. Trải qua 5 ngày nảy mầm, hoạt tính chống oxy hóa của đậu phộng tăng nhanh nhất trong 6 loại đậu, cụ thể từ 9,77% tăng lên 32,51%. Tiếp đó, tăng chậm hơn đôi chút là đậu nành, tăng từ 7,58% lên 26,94%, tăng chậm nhất là đậu đen (tăng 4,57%). Ở ngày thứ 5, polyphenols của đậu phộng có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất trong các loại đậu được khảo sát (32,51% gốc tự do bị cắt), đứng thứ hai là đậu nành với 26,94% gốc tự do bị cắt. Đậu đen có hoạt tính chống oxy hóa thấp nhất (7,44% gốc oxy hóa bị cắt). Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả về khả năng khử ion Fe3+ thu được ở thí nghiệm trên. Khả năng chống oxy hóa có liên quan chặt chẽ đến hàm lượng polyphenols tổng (Lee và cs., 2004). Như kết quả thu được ở thí nghiệm xác định nồng độ polyphenols, đậu phộng là đậu chứa hàm lượng polyphenols cao nhất nên trong phản ứng đánh giá khả năng chống oxy hóa, đậu phộng có hoạt tính cao nhất là điều phù hợp với kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng khử Fe3+

và thí nghiệm cắt gốc tự do DPPH. Ngoài ra, theo Corral-Aguayo và cs. (2008), nếu so sánh về khả năng chống oxy hóa, resveratrol có hoạt tính mạnh hơn so với flavonoids, và hoạt tính thấp nhất là phenolic acids. Bên cạnh đó, thành phần polyphenols chủ yếu trong đậu nành là flavonoids còn ở các loại đậu còn lại (đậu xanh, đen, đỏ, trắng) thành phần chủ yếu là phenolic acids (Sosulski và cs., 1982). Điều này có thể giải thích được vì sao đậu nành có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn 4 loại đậu còn lại.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

4.3. Phân tích trên hệ thống HPLC

Thực hiện phân tích thành phần polyphenols trong các loại đậu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với hai chất chuẩn là gallic acid và ferrulic acid, kết quả thu được như bảng 5.

Bảng 6. Thành phần polyphenols trong các loại đậu sau 5 ngày nảy mầm Mẫu Đậu xanh Đậu đen Đậu đỏ Đậu phộng Đậu nành Đậu trắng

Peak 1 + + + + + + Peak 2 + + + + + + Peak 3 - - - + - - Peak 4 - - - + - - Peak 5 - + + - + + Peak 6 - - - + - - Peak 7 - - - + - - Peak 8 - - - + - - Peak 9 - + + - + -

+: Peak xuất hiện trên sắc ký đồ -: Peak không xuất hiện trên sắc ký đồ

Dựa vào sắc ký đồ của hai chất chuẩn là gallic acid và ferrulic acid với 3 nồng độ khác nhau là 10, 50, và 100 µg/mL, có thể thấy peak của gallic acid xuất hiện vào khoảng phút thứ 2,07 và peak của ferrulic xuất hiện vào khoảng phút thứ 3,18. Hai peak này không trùng khớp với bất kỳ peak nào trong 9 peak của 6 loại đậu. Nguyên nhân có thể do thành phần polyphenols trong 6 loại đậu được khảo sát không có gallic acid và ferrulic acid. Bảng 5 liệt kê tất cả các peak xuất hiện ở 6 loại đậu, nhìn tổng quát đậu phộng xuất hiện đa số các peak liệt kê trong bảng. Điều đó chứng tỏ rằng