Phân đoạn cao dichloromethane được tiền hấp phụ với 100g silica gel, sấy khô, nghiền mịn. Sau đó, tiền hành sắc ký cột nhanh khô phân đoạn trên với các thông số như sau:
Pha tĩnh là silica gel 40-60 mesh (400g) Khối lượng cao dichloromethane: 100g. Đường kính cột d=12,5cm.
Chiều dài cột l=12,5cm.
Dung môi ổn định cột: n-hexane.
Hệ dung môi giải ly cột n-hexane : ethyl acetate (Hex:Ea), tăng dần độ phân cực hệ từ (Hex:Ea) (100:0) đến (Hex:Ea) (0:100), sau đó chạy tiếp hệ: ethyl acetate : methanol (Ea:Me), tăng dần độ phân cực và cuối cùng là chạy với methanol (100%).
Dung dịch giải ly ra khỏi cột được cho vào lọ với thể tích mỗi lần hứng là 250 mL. Sử dụng SKLM (TLC) để theo dõi quá trình chạy cột, hiện vết bằng đèn UV và bằng thuốc thử Vaniline trong MeOH và hơ trên bếp điện. Cô quay thu hồi dung môi, gom các lọ giống nhau (màu vết và Rf) thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột cao dichloromethane thu được 12 phân đoạn chính (OD01-OD12). Trong đó các phân đoạn OD4 và OD6 được chọn khảo sát tiếp. Kết quả sắc ký cột được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6 Kết quả SKC nhanh cao dichloromethane Hệ dung môi giải ly Số lọ Các phân đoạn Khối lượng
(g) Màu phân đoạn Hex:Ea ( 9:1) 1-18 OD1 0,1473 Tinh thể nâu đỏ Hex:Ea (8:2) 19-72 OD2 2,9379 Tinh thể vàng
tươi Hex:Ea (7:3) 73-84 OD3 1,5779 Tinh thể màu đỏ
Hex:Ea (6:4) 85-91 OD4 2,3778
Tinh thể xanh lục nhạt
92-101 OD5 5,5364 Tinh thể xanh lục
Hex:Ea (5:5) 102-112 OD6 9,5757
Tinh thể vàng xanh
113-150 OD7 23,9549 Tinh thể vàng nâu
Hex:Ea (3:7)
151-189 OD8 13,5749 Tinh thể xanh lục 199-202 OD9 7,5463 Nhựa màu nâu
nhạt Hex:Ea (2:8) 203-226 OD10 3,6443 Nhựa màu nâu Ea 100% 227-241
OD11 1,4535 Nhựa màu nâu Ea:Me (9:1) 241-271 Nhựa màu nâu MeOH 100% 271-275 OD12 7,4356 Nhựa màu đen
3.3.2.1 Khảo sát phân đoạn OD4
Tiến hành khảo sát tiếp tục phân đoạn OD4 phần lỏng. Khảo sát bằng SKLM cho kết quả tách tốt ở hệ chloroform và methanol.
Sắc ký cột: - Փ cột: 2 cm
- Dung môi giải ly: chloroform 100% tăng dần độ phân cực bằng methanol. - Silica gel tiền hấp phụ: 1,3 g.
- Thể tịch lọ hứng: 10 mL. - Lượng Silica gel dùng: 26 g.
Hình 3.6 Sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột OD4
Sử dụng SKLM (TLC) để theo dõi quá trình chạy cột, hiện vết bằng đèn UV và bằng thuốc thử Vaniline trong MeOH và hơ trên bếp điện. Cô quay thu hồi dung môi, gom các lọ giống nhau (màu vết và Rf) thành một phân đoạn.
Các lọ hứng giống nhau được gom chung lại sau đó cô quay thu hồi dung môi được các 8 phân đoạn được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7 Kết quả sắc ký cột phân đoạn OD4 Phân đoạn Dm giải ly cột Khối lượng
(g) Vết trên SKLM OD4.1 C 0,010 1 vết tím mờ
OD4.2 C 0,070 1 vết vàng, còn dơ nhiều
OD4.3 C 0,117 1 vàng chính
OD4.4 C 0,256 1 vệt tím dơ
OD4.5 C 0,130 1 vết cam chính, 1 vết tím mờ OD4.6 C:Me (99:1) 0,083 1 vết hồng chính, 1 vết xanh dơ OD4.7 C:Me (98:2) 0,100 Nhiều vết mờ
OD4.8 MeOH 0,200
Nhận thấy phân đoạn OD4.3 sau khi để bay hơi dung môi tự nhiên có xuất hiện kết tủa trắng và phần dầu màu vàng lục. Nhỏ dung môi Ethyl acetate lọ vào OD4.3 phần dầu tan tốt, phần kết tủa tan rất chậm. Rút hết phần dung dịch ra để riêng sang lọ khác, phần rắn còn lại màu trắng chưa sạch còn dơ đuôi. Tiếp tục làm tinh sạch bằng SKC với cột pippet 0,5cm, Silica gel Scharlau 60, hệ dung môi giải ly là chloroform xuyên suốt quá trình chạy cột.
Thu được một chất rắn màu trắng gần sạch. Sau đó, thực hiện kết tinh lại thu được một chất rắn màu trắng kết tinh hình kim sạch. Đặt tên hợp chất này là ORI.T1, tiến hành gửi đo phổ.
3.3.2.2 Khảo sát phân đoạn OD6
Tiến hành SKLM phân đoạn OD6 với hệ dung môi Hex:Ea (5:5) cho kết quả các vết tách xa nhau. Tiến hành SKC phân đoạn OD6
Sắc ký cột: - Փ cột: 3 cm
- Dung môi giải ly: Hệ giải ly đầu tiên là n-hexane:ethyl actetate (9:1) sau đó tăng dần độ phân cực bằng ethyl acetate.
- Silica gel tiền hấp phụ: 2 g. - Khối lượng cao: 5g
- Thể tịch lọ hứng: 50mL. - Lượng Silica gel dùng: 50 g.
Gom các lọ có vế giống nhau lại, cô quay thu hồi dung môi thu được các phân đoạn được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8 Kết quả sắc ký cột phân đoạn OD6 Phân đoạn Hệ dung môi
giải ly cột
Khối lượng (g)
Vết trên SKLM
OD6.1 Hex:Ea (9:1) 0,0335 Vết xanh dương rất mờ
OD6.2 Hex:Ea (8:2) 0,0092 1 vết hồng đẹp, còn dơ vệt tím mờ trên
OD6.3 Hex:Ea (8:2) 0,2063 1 vết vàng, hai vết xanh tím dơ OD6.4 Hex:Ea (8:2) 0,0688 Hai vết xanh tím và tím còn dơ
đầu
OD6.5 Hex:Ea (7:3) 0,0654 Hai vết xanh tím mờ và một vết vàng mờ
OD6.6 Hex:Ea (7:3) 0,0842 1 vết xanh tím mờ, 1 vết hồng rất mờ, 1 vết chính vàng
OD6.7 Hex:Ea (6:4) 0,1224 1 vết xanh tím mờ, 1 vết vàng và 1 vết xanh dương mờ
OD6.8 Hex:Ea(6:4) 0,3106 1 vết vàng cam
1 vết tím hồng chính
OD6.9 Hex:Ea (6:4) Hex:Ea (5:5)
0,0518 Vết vàng cam mờ, vết tím nâu mờ, kéo vệt
OD6.10 Ea 100% 0,1881 Kéo vệt dài không có vết chính OD6.11 MEOH 0,3192 Xã methanol
Phân đoạn OD6.8 có hai vết tách nhau xa có khả năng sẽ cô lập được chúng, nên chúng tôi tiếp tục khảo sát phân đoạn này. Tiến hành SKLM với hệ dung môi giải ly Hex:Ea (5:5) thấy tách tốt. Tiến hành sắc ký cột phân đoạn này như sau:
- Փ cột: 2 cm
- Dung môi giải ly: Hệ giải ly đầu tiên là n-hexane:ethyl acetate (5:5) sau đó tăng dần độ phân cực bằng ethyl acetate.
- Silica gel tiền hấp phụ: 0,3106g. - Thể tích lọ hứng: 10mL.
- Lượng Silica gel dùng: 9g.
Gom chung các lọ có vết giống nhau, cô quay đuổi dung môi thu được các phân đoạn được trình bày ở bảng 3.9.
Hình 3.7 Sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột tiểu phân đoạn OD6.8 Bảng 3.9 Các tiểu phân đoạn của phân đoạn OD6.8
Phân đoạn Hệ dung môi giải ly cột
Khối lượng
(g) Vết trên SKLM OD6.8.1 Hex:Ea (5:5) 0,0215 2 vết tím rất mờ OD6.8.2 Hex:Ea (5:5) 0,0652 1 vết vàng cam
1 vết tím hồng mờ
OD6.8.3 Hex:Ea (5:5) 0,1123 1 vết tím hồng, còn dơ đuôi
OD6.8.4 Ea 100% 0,0327 Vệt dài mờ
Tiếp tục khảo sát tiểu phân đoạn OD6.8.3 còn dơ đuôi, tiến hành SKC tiểu phân đoạn trên bằng cột pippet 0,5 cm, Silica gel Scharlau 60, và hệ dung môi giải ly là Hex:Ea (5:5) xuyên suốt quá trình sắc ký. Thu được một chất sạch dạng dầu màu vàng cam. Đặt tên cho hợp chất này là ORI.T2 và tiến hành gửi mẫu, xác định cấu trúc.
3.3.3 Thử hoạt tính kháng oxi hóa 3.3.3.1 Vitamin C