3.2.1 Phương pháp chiết tách
Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Phương pháp chiết rắn – lỏng ở đây là phương pháp chiết ngâm dầm (Maceration). Ưu điểm, không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng
thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy.
Phương pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần để điều chế các cao phân đoạn. Sử dụng bình lóng để lắc chiết.
3.2.2 Phân lập hợp chất hữu cơ
Để phân lập hợp chất hữu cơ tinh khiết từ cao thì sử dụng phương pháp chủ yếu là sắc ký nhanh cột khô, sắc ký cột hở và dùng sắc ký bản mỏng để theo dõi quá trình tách của cột. Ngoài ra, sắc ký bản mỏng còn giúp dự đoán hợp chất tách đã tinh khiết chưa.
3.2.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được
Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số lý hoá đặc trưng như: màu sắc, Rf, nhiệt độ nóng chảy, tan tốt trong những dung môi nào… Phổ 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR), 2D-NMR (HSQC, HMBC), MS được đo tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy, Hà Nội.
3.2.4 Hoạt tính kháng oxi hóa
Ngày càng có nhiều sự quan tâm đến những chất chống oxi hóa, mà nó liên quan đến sự ngăn chặn những ảnh hưởng xấu được cho là các gốc tự do gây ra trong cơ thể con người, để ngăn chặn thực phẩm và chất béo khỏi hỏng. Điều đó phù hợp với những chất kháng oxi hóa có nguồn gốc tự nhiên hơn là từ nguồn tổng hợp.
Vì vậy, nhiều phương pháp để dự đoán hiệu lực của những hợp chất được cho là có tính kháng oxi hóa cũng được phát triển theo. Trong đó phải kể đến phương pháp gốc tự do DPPH được sử dụng phổ biến do dễ thực hiện, cho kết quả nhanh. [11]
3.2.4.1 Nguyên tắc
Phân tử 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl: DPPH), là một trong số ít gốc nitro hữu cơ tự do ổn định. DPPH mang màu tím đậm (có cực đại hấp thu ở bước sóng 517 nm) có thể hòa tan trong dung dịch nước hoặc methanol, kém bền dưới ánh sáng và nhiệt độ (nên được bảo quản trong tối và ở nhiệt độ thấp).
Trong thử nghiệm DPPH, các chất kháng oxi hóa khử gốc tự do DPPH thành diphenyl-picrylhydrazine có màu vàng. Đây là phương pháp dựa trên cơ sở DPPH bị khử trong dung dịch khi có sự hiện diện của chất kháng oxi hóa (có
khả năng cho hydro) để hình thành dạng diphenyl-picrylhydrazine (DPPH-H) trong phản ứng.[12]
Để đánh giá khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của chất kháng oxi hóa ta đo độ hấp thu của dung dịch sau phản ứng (ủ 30 phút, ở 37°C) ở bước sóng 517 nm bằng máy quang phổ UV-Vis.
Khả năng kháng oxy hóa thường biểu diễn thông qua phần trăm loại bỏ A (%). Phần trăm loại bỏ A (%) được tính theo biểu thức sau:
A% = ODc− (ODs− ODb)
ODc × 100%
Trong đó:
A%: phần trăm loại bỏ gốc tự do DPPH.
ODc: Độ hấp thu quang của hỗn hợp không có mẫu thử. ODm: Độ hấp thu quang của hỗn hợp có mẫu thử. ODb: Độ hấp thu quang của mẫu thử.
3.2.4.2 Phản ứng
Dạng màu tím đậm của gốc DPPH bị khử do những hợp chất kháng oxi hóa (RH) tạo thành hợp chất hydrazine tương ứng có màu vàng nhạt.
Hình 3.1 Phản ứng khử gốc tự do DPPH
(*)
3.2.4.3 Chuẩn bị hóa chất a. Dung dịch DPPH
Cân chính xác 3 mg DPPH hòa tan vào 30 mL methanol. Sau đó cho dung dịch trên vào bình định mức 50 mL, định mức tới vạch bằng methanol. Dung dịch vừa pha có nồng độ là 60 µg/mL, được bảo quản trong tối và ở nhiệt độ thấp (-4°C, ngăn đá tủ lạnh).
b. Chuẩn bị mẫu
− Cân chính xác 10 mg mẫu, hòa tan với 6 mL MeOH. Cho dung dịch này vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng MeOH. Trộn đều thu được dung dịch mẫu 1000 µg/mL.
− Hút chính xác 1 mL dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch. Trộn đều thu được dung dịch mẫu 100 µg/mL, được bảo quản ở nhiệt độ phòng. Bố trí thí nghiệm trên cao như sau:
Dãy nồng độ của Vitamin C
Bảng 3.1 Dãy nồng độ của Vitamin C
STT Vitamin C MeOH (mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 2 0,04 1,96 2 4 0,08 1,92 3 6 0,12 1,88 4 8 0,16 1,84 5 10 0,20 1,80 6 12 0,24 1,76 Các loại cao Bảng 3.2 Dãy các cao ở cùng nồng độ 50 µg/mL Các loại cao Thể tích hút (mL) Nồng độ cao (µg/mL) Thể tích cao cần pha (mL) n-hexane 1,0 50 2,0 dichloromethane Ethyl acetate methanol
Cao DC
Bảng 3.3 Dãy nồng độ của cao DC
STT Cao dichloromethane MeOH (mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 10 0,2 1,8 2 20 0,4 1,6 3 30 0,6 1,4 4 40 0,8 1,2 5 50 1,0 1,0 Cao Ea
Bảng 3.4 Dãy nồng độ của cao Ea
STT
Cao Ethyl acetate
MeOH (mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 10 0,2 1,8 2 20 0,4 1,6 3 30 0,6 1,4 4 40 0,8 1,2 5 50 1,0 1,0 6 60 1,2 0,8 Hợp chất ORI.T1
Bảng 3.5 Dãy nồng độ của ORI.T1
STT Chất ORI.T1 MeOH (mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 5 0,1 1,9 2 10 0,2 1,8 3 15 0,3 1,7 4 20 0,4 1,6 5 25 0,5 1,5 6 30 0,6 1,4
Mỗi mẫu hút 1 mL trộn với 1 mL dd DPPH 60 µg/mL, hỗn hợp này được ủ trong bóng tối 30 phút, ở nhiệt độ phòng. Tất cả các quá trình đều phải thực hiện trong bóng tối. Quy trình thử nghiệm được tóm tắt ở hình 3.2.
Hình 3.2 Tóm tắt thí nghiệm kháng oxi hóa bằng DPPH
3.2.4.4 EC50 và cách xác định a. EC50
EC50 là giá trị dùng để đánh giá hoạt tính của mẫu khảo sát. EC50 được định nghĩa là nồng độ (µg/mL) của mẫu chất tại đó nó có thể loại bỏ 50% gốc tự do, tế bào, enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị EC50 càng thấp.
b. Cách xác định
Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau.
Biểu thức (*) cho thấy giá trị A% loại bỏ tỉ lệ bậc nhất với nồng độ chất khảo sát. Từ giá trị nồng độ mẫu chất khảo sát và mật độ quang tương ứng, xây dựng đường thẳng tuyến tính có dạng y = ax + b (1) (y là phần trăm loại bỏ gốc tự do DPPH của mẫu khảo sát, x là nồng độ mẫu chất khảo sát, x>0).
Thay y = 50% vào phương trình (1), thu được giá trị x. Đó chính là nồng độ loại bỏ 50% gốc tự do DPPH (hay EC50) DPPH hòa vào Me (60 µg/mL) Mẫu thử pha trong Me (µg/mL) -Ủ 30 phút trong tối -Nhiệt độ phòng Đo OD λmax=517 nm Nhiệt độ phòng Nhiệt độ ở −4°C Giữ trong tối 1 mL 1 mL
3.3 Thực nghiệm 3.3.1 Điều chế các cao 3.3.1 Điều chế các cao
Vỏ thân cây Núc nác phơi khô, xay nhuyễn thành bột (9,2 kg) được tận trích với MeOH bằng phương pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô quay và thu hồi dung môi dưới áp suất kém. Thực hiện nhiều lần thu được cao MeOH dạng sệt có khối lượng 1,6 kg. Cao MeOH hòa tan trong một lượng nước vừa đủ, sau đó được chiết lần lượt với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần: n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate.
Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết với n-hexane đem cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất kém thu được cao n-hexane có khối lượng 33,54 gam.
Phần không tan trong n-hexane tiếp tục được chiết với dichloromethane. Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết đem cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất kém thu được cao dichloromethane có khối lượng 110,85 gam.
Phần không tan trong dichloromethane tiếp tục được chiết với ethyl acetate. Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết đem cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất kém thu được cao ethyl acetate có khối lượng 153,35 gam.
Phần dịch nước còn lại được đun cách thủy làm bay hơi nước thu được cao nước có khối lượng 217,43 gam.
Trong bài luận văn này, nghiên cứu tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cao dichloromethane.
Quy trình chiết tách được tóm tắt như hình 3.4
Hình 3.4 Tóm tắt quy trình điều chế cao Vỏ cây Núc nác
Bột vỏ cây (9,2 kg)
-Làm sạch, phơi gió -Sấy 60°C, xay nhuyễn
Cao methanol tổng
(1,6 kg)
-Ngâm với methanol, lọc loại bã -Cô quay loại dung môi
- Pha loãng với H2O:Me (1:1) - Chiết với n-hexane, cô đuổi dm
-Chiết với dicloromethane -Lấy lớp dưới, cô đuổi dung môi
-Chiết với Ethyl acetate
-Lấy lớp trên, cô đuổi dung môi
Cao n-hexane (33,54 gam)
-Đun cách thủy
Cao dicloromethane ( 110,85 gam)
Cao ethyl acetate ( 153,35 gam)
Cao methanol ( 217,43 gam)
Phần không tan trong n-hexane
Phần không tan trong dichloromethane
Phần không tan trong ethyl acetate
3.3.2 Khảo sát cao dichloromethane
Phân đoạn cao dichloromethane được tiền hấp phụ với 100g silica gel, sấy khô, nghiền mịn. Sau đó, tiền hành sắc ký cột nhanh khô phân đoạn trên với các thông số như sau:
Pha tĩnh là silica gel 40-60 mesh (400g) Khối lượng cao dichloromethane: 100g. Đường kính cột d=12,5cm.
Chiều dài cột l=12,5cm.
Dung môi ổn định cột: n-hexane.
Hệ dung môi giải ly cột n-hexane : ethyl acetate (Hex:Ea), tăng dần độ phân cực hệ từ (Hex:Ea) (100:0) đến (Hex:Ea) (0:100), sau đó chạy tiếp hệ: ethyl acetate : methanol (Ea:Me), tăng dần độ phân cực và cuối cùng là chạy với methanol (100%).
Dung dịch giải ly ra khỏi cột được cho vào lọ với thể tích mỗi lần hứng là 250 mL. Sử dụng SKLM (TLC) để theo dõi quá trình chạy cột, hiện vết bằng đèn UV và bằng thuốc thử Vaniline trong MeOH và hơ trên bếp điện. Cô quay thu hồi dung môi, gom các lọ giống nhau (màu vết và Rf) thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột cao dichloromethane thu được 12 phân đoạn chính (OD01-OD12). Trong đó các phân đoạn OD4 và OD6 được chọn khảo sát tiếp. Kết quả sắc ký cột được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6 Kết quả SKC nhanh cao dichloromethane Hệ dung môi giải ly Số lọ Các phân đoạn Khối lượng
(g) Màu phân đoạn Hex:Ea ( 9:1) 1-18 OD1 0,1473 Tinh thể nâu đỏ Hex:Ea (8:2) 19-72 OD2 2,9379 Tinh thể vàng
tươi Hex:Ea (7:3) 73-84 OD3 1,5779 Tinh thể màu đỏ
Hex:Ea (6:4) 85-91 OD4 2,3778
Tinh thể xanh lục nhạt
92-101 OD5 5,5364 Tinh thể xanh lục
Hex:Ea (5:5) 102-112 OD6 9,5757
Tinh thể vàng xanh
113-150 OD7 23,9549 Tinh thể vàng nâu
Hex:Ea (3:7)
151-189 OD8 13,5749 Tinh thể xanh lục 199-202 OD9 7,5463 Nhựa màu nâu
nhạt Hex:Ea (2:8) 203-226 OD10 3,6443 Nhựa màu nâu Ea 100% 227-241
OD11 1,4535 Nhựa màu nâu Ea:Me (9:1) 241-271 Nhựa màu nâu MeOH 100% 271-275 OD12 7,4356 Nhựa màu đen
3.3.2.1 Khảo sát phân đoạn OD4
Tiến hành khảo sát tiếp tục phân đoạn OD4 phần lỏng. Khảo sát bằng SKLM cho kết quả tách tốt ở hệ chloroform và methanol.
Sắc ký cột: - Փ cột: 2 cm
- Dung môi giải ly: chloroform 100% tăng dần độ phân cực bằng methanol. - Silica gel tiền hấp phụ: 1,3 g.
- Thể tịch lọ hứng: 10 mL. - Lượng Silica gel dùng: 26 g.
Hình 3.6 Sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột OD4
Sử dụng SKLM (TLC) để theo dõi quá trình chạy cột, hiện vết bằng đèn UV và bằng thuốc thử Vaniline trong MeOH và hơ trên bếp điện. Cô quay thu hồi dung môi, gom các lọ giống nhau (màu vết và Rf) thành một phân đoạn.
Các lọ hứng giống nhau được gom chung lại sau đó cô quay thu hồi dung môi được các 8 phân đoạn được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7 Kết quả sắc ký cột phân đoạn OD4 Phân đoạn Dm giải ly cột Khối lượng
(g) Vết trên SKLM OD4.1 C 0,010 1 vết tím mờ
OD4.2 C 0,070 1 vết vàng, còn dơ nhiều
OD4.3 C 0,117 1 vàng chính
OD4.4 C 0,256 1 vệt tím dơ
OD4.5 C 0,130 1 vết cam chính, 1 vết tím mờ OD4.6 C:Me (99:1) 0,083 1 vết hồng chính, 1 vết xanh dơ OD4.7 C:Me (98:2) 0,100 Nhiều vết mờ
OD4.8 MeOH 0,200
Nhận thấy phân đoạn OD4.3 sau khi để bay hơi dung môi tự nhiên có xuất hiện kết tủa trắng và phần dầu màu vàng lục. Nhỏ dung môi Ethyl acetate lọ vào OD4.3 phần dầu tan tốt, phần kết tủa tan rất chậm. Rút hết phần dung dịch ra để riêng sang lọ khác, phần rắn còn lại màu trắng chưa sạch còn dơ đuôi. Tiếp tục làm tinh sạch bằng SKC với cột pippet 0,5cm, Silica gel Scharlau 60, hệ dung môi giải ly là chloroform xuyên suốt quá trình chạy cột.
Thu được một chất rắn màu trắng gần sạch. Sau đó, thực hiện kết tinh lại thu được một chất rắn màu trắng kết tinh hình kim sạch. Đặt tên hợp chất này là ORI.T1, tiến hành gửi đo phổ.
3.3.2.2 Khảo sát phân đoạn OD6
Tiến hành SKLM phân đoạn OD6 với hệ dung môi Hex:Ea (5:5) cho kết quả các vết tách xa nhau. Tiến hành SKC phân đoạn OD6
Sắc ký cột: - Փ cột: 3 cm
- Dung môi giải ly: Hệ giải ly đầu tiên là n-hexane:ethyl actetate (9:1) sau đó tăng dần độ phân cực bằng ethyl acetate.
- Silica gel tiền hấp phụ: 2 g. - Khối lượng cao: 5g
- Thể tịch lọ hứng: 50mL. - Lượng Silica gel dùng: 50 g.
Gom các lọ có vế giống nhau lại, cô quay thu hồi dung môi thu được các phân đoạn được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8 Kết quả sắc ký cột phân đoạn OD6 Phân đoạn Hệ dung môi
giải ly cột
Khối lượng (g)
Vết trên SKLM
OD6.1 Hex:Ea (9:1) 0,0335 Vết xanh dương rất mờ
OD6.2 Hex:Ea (8:2) 0,0092 1 vết hồng đẹp, còn dơ vệt tím mờ trên
OD6.3 Hex:Ea (8:2) 0,2063 1 vết vàng, hai vết xanh tím dơ OD6.4 Hex:Ea (8:2) 0,0688 Hai vết xanh tím và tím còn dơ
đầu
OD6.5 Hex:Ea (7:3) 0,0654 Hai vết xanh tím mờ và một vết vàng mờ
OD6.6 Hex:Ea (7:3) 0,0842 1 vết xanh tím mờ, 1 vết hồng rất mờ, 1 vết chính vàng
OD6.7 Hex:Ea (6:4) 0,1224 1 vết xanh tím mờ, 1 vết vàng và 1 vết xanh dương mờ
OD6.8 Hex:Ea(6:4) 0,3106 1 vết vàng cam
1 vết tím hồng chính
OD6.9 Hex:Ea (6:4) Hex:Ea (5:5)
0,0518 Vết vàng cam mờ, vết tím nâu mờ, kéo vệt
OD6.10 Ea 100% 0,1881 Kéo vệt dài không có vết chính OD6.11 MEOH 0,3192 Xã methanol
Phân đoạn OD6.8 có hai vết tách nhau xa có khả năng sẽ cô lập được chúng, nên chúng tôi tiếp tục khảo sát phân đoạn này. Tiến hành SKLM với hệ dung môi giải ly Hex:Ea (5:5) thấy tách tốt. Tiến hành sắc ký cột phân đoạn này như sau:
- Փ cột: 2 cm
- Dung môi giải ly: Hệ giải ly đầu tiên là n-hexane:ethyl acetate (5:5) sau đó tăng dần độ phân cực bằng ethyl acetate.
- Silica gel tiền hấp phụ: 0,3106g. - Thể tích lọ hứng: 10mL.
- Lượng Silica gel dùng: 9g.
Gom chung các lọ có vết giống nhau, cô quay đuổi dung môi thu được các phân đoạn được trình bày ở bảng 3.9.
Hình 3.7 Sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột tiểu phân đoạn OD6.8 Bảng 3.9 Các tiểu phân đoạn của phân đoạn OD6.8
Phân đoạn Hệ dung môi giải ly cột
Khối lượng
(g) Vết trên SKLM OD6.8.1 Hex:Ea (5:5) 0,0215 2 vết tím rất mờ OD6.8.2 Hex:Ea (5:5) 0,0652 1 vết vàng cam
1 vết tím hồng mờ
OD6.8.3 Hex:Ea (5:5) 0,1123 1 vết tím hồng, còn dơ đuôi
OD6.8.4 Ea 100% 0,0327 Vệt dài mờ
Tiếp tục khảo sát tiểu phân đoạn OD6.8.3 còn dơ đuôi, tiến hành SKC tiểu phân đoạn trên bằng cột pippet 0,5 cm, Silica gel Scharlau 60, và hệ dung môi giải ly là Hex:Ea (5:5) xuyên suốt quá trình sắc ký. Thu được một chất sạch dạng dầu màu vàng cam. Đặt tên cho hợp chất này là ORI.T2 và tiến hành gửi mẫu, xác định cấu trúc.
3.3.3 Thử hoạt tính kháng oxi hóa 3.3.3.1 Vitamin C 3.3.3.1 Vitamin C
Bảng 3.10 Nồng độ mẫu thử, giá trị mật độ quang và phần trăm loại bỏ DPPH của Vitamin C
Nồng độ Vit C (µg/mL)
Mật độ quang Phần trăm loại bỏ (%) ODS ODb ODc 2 0,603 0,046 0,7065 21,16 4 0,521 32,77