3.1.1 Địa điểm và thời gian
Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh 1, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện: từ 19/01/2015 đến 19/04/2015.
3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ 3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ
Bộ chƣng cất tinh dầu nhẹ Clevenger. Bình cầu 100 mL, 1000 mL.
Bình định mức 100 mL, 250 mL. Bếp đun hoàn lƣu Heating Green. Bình tam giác 250 mL.
Burette 25 mL.
Cân điện tử SATORRIUS 210 0,0001 g.
Cốc thủy tinh 100 mL, 500 mL, 1000 mL. Đĩa petri thủy tinh 100 x 15 mm.
Hệ thống GC – MS. Micropipette 100 – 1000 L. Ống đong 10 mL. 3.1.2.2 Hóa chất Ethanol 96o. Diethyl ether.
Dung dịch KOH 0,1 N trong ethanol. Dung dịch HCl 0,1 N trong ethanol.
Na2SO4 khan.
3.1.3 Nguyên liệu
Mẫu Chanh trong thí nghiệm là mẫu Chanh đƣợc thu hái tại vƣờn thuộc huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long.
Qua sự định danh của Ts. Đặng Minh Quân – Bộ môn Sƣ phạm Sinh học, Khoa Sƣ phạm, Trƣờng Đại học Cần Thơ thì mẫu Chanh đƣợc sử dụng
trong nghiên cứu có tên khoa học là Citrus limonia Osbeck.
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra của đề tài, nghiên cứu đƣợc tiến hành song song ở 2 mẫu nguyên liệu là vỏ Chanh và lá Chanh theo các bƣớc sau:
Thu mua và xử lý nguyên liệu.
Ly trích tinh dầu bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc.
Xác định các chỉ tiêu lý – hóa của tinh dầu.
Khảo sát thành phần hóa học trong tinh dầu bằng hệ thống sắc ký khí
ghép khối phổ (GC – MS).
Khảo sát hoạt tính kháng nấm của tinh dầu.
3.2.1 Xử lý nguyên liệu
Mẫu Chanh sau khi thu về sẽ đƣợc xử lý sơ bộ bằng cách loại bỏ các tạp lẫn nhƣ cỏ, lá tạp hoặc các phần không đạt yêu cầu nhƣ quả bị sâu hay lá bị dập, úng. Sau đó, mẫu đƣợc chia thành 2 phần là vỏ và lá rồi rửa sạch và để ráo nƣớc. Tiếp theo, cả 2 mẫu sẽ đƣợc cắt nhuyễn và tiến hành ly trích song song với nhau.
3.2.2 Ly trích tinh dầu bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc nƣớc
Quy trình ly trích vỏ và lá Chanh kiên dựa vào quy trình ly trích vỏ và lá Chanh của Stavroula A. Vekiari công bố trên tạp chí khoa học Journal of Agricultural and Food Chemistry [10].
Cân 150 g mẫu Chanh đã đƣợc cắt nhuyễn cho vào bình cầu 1000 mL, rót nƣớc cất vào bình sao cho thể tích nƣớc trong bình không vƣợt quá 2/3 thể tích của bình cầu. Nếu cho nƣớc quá nhiều thì trong quá trình đun xác mẫu trong bình cầu sẽ trào lên bộ phận hứng lấy tinh dầu. Lắp bình cầu vào hệ thống gồm bếp đun hoàn lƣu, ống hứng tinh dầu và ống sinh hàn rồi tiến hành ly trích trong 3 h. Sau khi quá trình ly trích hoàn tất, hỗn hợp tinh dầu thu đƣợc gồm tinh dầu Chanh và nƣớc. Hỗn hợp sẽ đƣợc chiết với diethyl ether để
loại bỏ nƣớc. Làm khan bằng Na2SO4 và làm bay hơi diethyl ether, thu đƣợc tinh dầu Chanh. Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng nấm của mẫu tinh dầu thu đƣợc, đồng thời phân tích thành phần mẫu tinh dầu bằng GC – MS.
Hình 3.1: Quy trình ly trích tinh dầu Chanh bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chanh
Bình chƣng cất
Ly trích bằng lôi cuốn hơi nƣớc
Tinh dầu Chanh Hỗn hợp tinh dầu và nƣớc Khảo sát thành phần hóa học Khảo sát hoạt tính kháng nấm
Loại bỏ mẫu không đạt yêu cầu
Cắt nhuyễn
Chiết với diethyl ether
Làm khan bằng Na2SO4
3.2.3 Xác định một số chỉ tiêu lý – hóa của tinh dầu Chanh kiên [4, 11-13] 11-13]
Mẫu tinh dầu thu đƣợc sau khi ly trích bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc dùng để xác định các chỉ tiêu sau:
3.2.3.1 Đánh giá cảm quan
Phân tích sơ bộ chất lƣợng tinh dầu bằng cảm quan dựa trên việc quan sát những dấu hiệu bên ngoài nhƣ mùi, vị, màu sắc và độ trong suốt.
Bằng cách này có thể đánh giá sơ bộ về chất lƣợng tinh dầu và mục đích sử dụng của tinh dầu.
Màu sắc và độ trong suốt: xác định bằng cách lấy 20 mL tinh dầu cho vào một ống nghiệm khô, sạch, trong suốt. Quan sát bằng mắt thƣờng màu sắc của tinh dầu. Mẫu tinh dầu đƣợc xem nhƣ trong suốt nếu không có vẩn đục hoặc những sợi lơ lững. Khi cần, so sánh màu sắc của phần mẫu thử với mẫu tinh dầu chuẩn tƣơng ứng cho từng loại tinh dầu.
Mùi: xác định bằng cách nhỏ vài giọt tinh dầu lên giấy thấm khô, sạch,
không có mùi lạ. Dùng mũi xác định mùi của tinh dầu từ 4 đến 5 lần, cứ 15 phút xác định một lần. Khi cần, so sánh mùi của phần mẫu thử với mẫu tinh dầu chuẩn tƣơng ứng cho từng loại tinh dầu.
Vị: xác định bằng cách cân 1 g đƣờng kính cho vào chén thử khô, sạch,
không có mùi vị lạ. Nhỏ vài giọt tinh dầu vào chén, trộn đều, dùng lƣỡi xác định vị của hỗn hợp đó. Khi cần, so sánh vị của phần mẫu thử với mẫu tinh dầu chuẩn tƣơng ứng cho từng loại tinh dầu.
3.2.3.2 Chỉ số acid
Chỉ số acid là số miligam KOH cần để trung hòa các acid tự do chứa trong 1 gam tinh dầu. Chỉ số acid phụ thuộc vào mức độ tƣơi và thời gian bảo quản của tinh dầu. Khi bảo quản lâu, chỉ số acid sẽ tăng lên do bị oxi hóa và ester trong tinh dầu bị phân giải.
Các xác định
Xác định dựa vào phản ứng trung hòa:
Từ lƣợng kiềm dùng để trung hòa acid tự do, tính đƣợc chỉ số acid. Để xác định chỉ số acid, cân khoảng 1 g tinh dầu cho vào bình tam giác, hòa tan bằng 5 mL ethanol, thêm vài giọt phenolphthalein. Chuẩn độ dịch lỏng bằng
dung dịch KOH 0,1 N trong ethanol đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, bền trong 30 giây. Ghi lại thể tích của dung dịch KOH 0,1 N đã đƣợc sử dụng.
Chỉ số acid đƣợc tính bằng công thức:
Trong đó:
IA: chỉ số acid;
5,611: lƣợng KOH chứa trong 1 mL dung dịch KOH 0,1 N (mg); V: thể tích dung dịch KOH 0,1 N đã dùng để chuẩn độ mẫu (mL); m: lƣợng tinh dầu dùng trong thí nghiệm (g). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.3.3 Chỉ số xà phòng hóa
Chỉ số xà phòng hóa là số miligam KOH cần thiết để trung hòa tất cả các acid tự do và acid kết hợp có trong 1 gam tinh dầu.
Các xác định
Cân khoảng 1 g tinh dầu cho vào bình cầu 100 mL, thêm vào 10 mL dung dịch KOH 0,1 N trong ethanol. Lắp ống sinh hàn vào bình cầu và đun cách thủy khoảng 1 giờ để phản ứng xà phòng hóa kết thúc. Để nguội, thêm 5 mL nƣớc cất và vài giọt phenolphthalein, dung dịch chuyển sang màu hồng. Chuẩn độ dịch lỏng bằng dung dịch HCl 0,1 N trong ethanol cho đến khi mất màu hồng. Tiến hành song song với mẫu trắng, đồng thời chuẩn độ mẫu trắng trƣớc khi chuẩn mẫu thử.
Chỉ số xà phòng hóa đƣợc tính theo công thức:
Trong đó:
IS: chỉ số xà phòng hóa;
5,611: lƣợng KOH chứa trong 1 mL dung dịch KOH 0,1 N (mg);
V1: thể tích dung dịch HCl 0,1 N đã dùng để chuẩn độ mẫu trắng (mL);
V2: thể tích dung dịch HCl 0,1 N đã dùng để chuẩn độ mẫu thử (mL);
3.2.3.4 Chỉ số ester
Chỉ số ester là số miligam KOH dùng để trung hòa lƣợng acid đƣợc giải phóng do thủy phân các ester có trong 1 gam tinh dầu. Chỉ số ester xác định bằng cách lấy chỉ số xà phòng hóa trừ đi chỉ số acid.
Trong đó: IE: chỉ số ester;
IS: chỉ số xà phòng hóa;
IA: chỉ số acid.
3.2.4 Xác định thành phần hóa học chính của tinh dầu Chanh kiên bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) [14] bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) [14]
Tinh dầu Chanh kiên thu đƣợc sau khi ly trích sẽ đƣợc phân tích thành phần hóa học bằng hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) Thermo Scientific tại phòng Sắc ký – Quang phổ, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trƣờng Đại học Cần Thơ. Cột sử dụng trong phân tích là cột có ký
hiệu TB – SQC (15 m x 0,25 mm x 0,25 m), khí mang là Heli, với các điều
kiện chạy phân tích nhƣ sau:
3.2.4.1 Điều kiện của sắc ký khí
Chƣơng trình nhiệt độ cho máy sắc ký khí đƣợc thiết lập nhƣ sau:
Initial: Nhiệt độ đầu ở 50 oC, giữ 1 phút.
Ram 1: Tăng lên 70 oC với tốc độ 2 oC/phút, giữ 1 phút.
Ram 2: Tăng lên 150 oC với tốc độ 5 oC/phút, giữ 2 phút.
Ram 3: Tăng lên 230 oC với tốc độ 10 oC/phút, giữ 1 phút.
3.2.4.2 Điều kiện của khối phổ Nguồn ion hóa EI:
Nhiệt độ bắn phá ion: 230 oC.
Nhiệt độ stranferline: 275 oC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chế độ quét: Fullscan. Khối quét: 35 – 400 amu.
Tiêm mẫu:
Chế độ tiêm mẫu chia dòng. Tỉ lệ chia dòng: 10.
Thể tích tiêm mẫu: 1 L.
3.2.4.3 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu Chanh kiên
Thành phần hóa học của tinh dầu đƣợc xác định nhƣ sau:
Xác định thời gian lƣu của các chất trên sắc ký đồ giống với thời gian
lƣu của những chất đã biết trƣớc.
Đối chiếu khối phổ thu đƣợc với phổ gốc trong thƣ viện phổ NIST, từ
đó định danh các cấu tử trong tinh dầu Chanh kiên, đồng thời dựa trên tỉ lệ diện tích peak của các cấu tử xác định tỉ lệ % các chất trong mẫu phân tích.
3.2.5 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của tinh dầu Chanh kiên [15-17] 17]
Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của tinh dầu Chanh kiên đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học 8, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trƣờng Đại học Cần Thơ. Nấm sử dụng trong thử nghiệm là nấm
Fusarium oxysporum f.sp. niveum, một loài nấm gây héo do tắc bó mạch trên dƣa hấu.
3.2.5.1 Giới thiệu nấm Fusarium oxysporum f.sp. niveum
Hình 3.2: Đĩa nấm Fusarium oxysporum f.sp. niveum
Phổ ký chủ: Mỗi loài Fusarium oxysporum thƣờng chỉ gây héo cho một
loại ký chủ nhất định. Trong trƣờng hợp Fusarium oxysporum f.sp. niveum thì
gây héo trên dƣa hấu (chạy dây).
Khả năng tồn tại của mầm bệnh: mầm bệnh có thể tồn tại trong hạt, đất hay xác, bã thực vật. Khả năng tồn tại của mầm bệnh trong đất có thể đến 16 năm.
3.2.5.2 Phƣơng pháp thực hiện
Môi trƣờng nuôi cấy là PDA (thạch đƣờng khoai tây):
Khoai tây: 200 g
D-Glucose: 20 g
Agar: 20 g
Nƣớc cất: 1 L
Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trƣờng PDA có chứa nồng độ tinh dầu lần lƣợt là 0, 500, 1000, 2000, 4000 và 8000 ppm. Mẫu không có tinh dầu là mẫu đối chứng. Rót khoảng 10 mL môi trƣờng vào đĩa petri. Dùng dụng cụ dục lỗ (đƣờng kính 7 mm) đục lấy khoanh nấm từ đĩa nguồn rồi chuyển vào giữa các đĩa petri đã đổ môi trƣờng. Sau đó dùng màng bọc thực phẩm (food wrap) bao xung quanh đĩa và để các đĩa trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kiểm tra và ghi nhận bán kính phát triển của nấm sau 2, 4, 6 ngày nuôi cấy. Đánh giá kết quả kháng nấm của mẫu thử thông qua bán kính phát triển của mẫu thử và từ đó tính đƣợc hiệu suất đối kháng (HSĐK).
Công thức tính hiệu suất đối kháng:
Trong đó: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
HSĐK: hiệu suất đối kháng (%);
BKĐC: bán kính phát triển của nấm ở mẫu đối chứng (mm); BKMT: bán kính phát triển của nấm ở mẫu thử (mm).
Chƣơng 4:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Hiệu suất ly trích tinh dầu
Hiệu suất ly trích tinh dầu vỏ Chanh kiên:
Hiệu suất ly trích tinh dầu lá Chanh kiên:
4.2 Xác định các chỉ tiêu lý – hóa của tinh dầu Chanh kiên 4.2.1 Đánh giá cảm quan 4.2.1 Đánh giá cảm quan
Tinh dầu Chanh kiên sau khi ly trích bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc là chất lỏng linh động, trong suốt và có các đặc điểm sau:
Màu: tinh dầu vỏ Chanh không màu, tinh dầu lá Chanh có màu vàng
nhạt.
Mùi: có mùi Chanh đặc trƣng.
Vị: the, đắng, tính ấm.
Hình 4.1: Tinh dầu vỏ và lá Chanh kiên
4.2.2 Xác định các chỉ số acid, xà phòng hóa và ester
Xác định các chỉ số acid, xà phòng hóa và ester nhƣ các phƣơng pháp đã trình bày, lặp lại thí nghiệm 3 lần cho mỗi mẫu thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
4.2.2.1 Tinh dầu vỏ Chanh kiên
Bảng 4.1: Kết quả chuẩn độ xác định chỉ số acid tinh dầu vỏ Chanh kiên
Số lần Khối lƣợng tinh dầu (g) Thể tích KOH 0,1 N (mL)
1 1,0012 0,3500
2 1,0005 0,3500
3 1,0034 0,4000
Trung bình 1,0017 0,3667
IA 2,5041
Bảng 4.2: Kết quả chuẩn độ xác định chỉ số xà phòng hóa và ester tinh dầu vỏ Chanh kiên
Số lần Khối lƣợng tinh dầu
(g)
Thể tích HCl 0,1 N chuẩn độ mẫu tinh dầu (mL) Thể tích HCl 0,1 N chuẩn độ mẫu trắng (mL) 1 1,0027 6,3000 7,4000 2 1,0006 6,2000 7,4000 3 0,9999 6,2000 7,4000 Trung bình 1,0011 6,2333 7,4000 IS 6,5392 IE 4,0351 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.2.2.2 Tinh dầu lá Chanh kiên
Bảng 4.3: Kết quả chuẩn độ xác định chỉ số acid tinh dầu lá Chanh kiên
Số lần Khối lƣợng tinh dầu (g) Thể tích KOH 0,1 N (mL)
1 1,0007 0,2000
2 0,9995 0,2000
3 0,9998 0,2000
Trung bình 1,0000 0,2000
Bảng 4.4: Kết quả chuẩn độ xác định chỉ số xà phòng hóa và ester tinh dầu lá Chanh kiên
Số lần Khối lƣợng tinh dầu
(g)
Thể tích HCl 0,1 N chuẩn độ mẫu tinh dầu (mL) Thể tích HCl 0,1 N chuẩn độ mẫu trắng (mL) 1 1,0001 4,9000 7,3500 2 1,0013 4,9000 7,4000 3 1,0012 4,9000 7,4000 Trung bình 1,0009 4,9000 7,3833 IS 13,9213 IE 12,7991
Qua các số liệu thực nghiệm cho thấy chỉ số acid của 2 mẫu tinh dầu đều thấp chứng tỏ quá trình ly trích đã ít làm thay đổi tích chất cũng nhƣ thành phần của tinh dầu. Mặc khác, chỉ số ester của tinh dầu lá Chanh kiên cao hơn tinh dầu vỏ Chanh kiên chứng tỏ hàm lƣợng ester trong tinh dầu lá Chanh kiên nhiều hơn tinh dầu vỏ Chanh kiên.
4.3 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu Chanh kiên bằng phƣơng pháp GC – MS phƣơng pháp GC – MS
4.3.1 Thành phần hóa học của tinh dầu Chanh kiên
Qua phân tích GC – MS thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Bảng 4.5: Thành phần hóa học của tinh dầu vỏ Chanh kiên
STT Hợp chất Thời gian lƣu
(phút) Hàm lƣợng (%) 1 -Thujene 2,5 0,93 2 -Pinene 2,6 2,26 3 -Pinene 3,43 11,75 4 Myrcene 3,87 2,33 5 Octanal 4,22 0,15 6 Limonene 4,87 59,43
8 -Terpinene 5,83 14,39 9 -Humulene 6,89 0,72 10 Linalool 7,58 0,13 11 Citronellal 9,94 0,39 12 Terpinen-4-ol 10,79 0,3 13 -Terpineol 11,57 0,53 14 -Caryophyllene 20,04 0,66 15 tran--Bergamotene 20,72 0,38 16 Germacrene D 21,83 0,37 17 Bicyclogermacrene 22,27 0,11 18 -Bisabolene 22,81 0,43 19 (E,E)--Farnesene 22,91 0,22 20 Benzeneethanamine 32,62 0,26 21 1,3-bis(trimethylsilyloxy)propan-2-yl (9E,12E,15E)-octadeca-9,12,15- trienoate 38,7 0,12 Tổng 96,33
Bảng 4.6: Thành phần hóa học của tinh dầu lá Chanh kiên
STT Hợp chất Thời gian lƣu
(phút) Hàm lƣợng (%) 1 -Pinene 2,58 0,64 2 -Pinene 3,43 10,55 3 Myrcene 3,85 1,39 4 Limonene 4,86 22,34 5 -Ocimene 5,23 0,77 6 -Ocimene 5,55 3,11 7 -Terpinene 5,82 0,59 8 Linalool 7,51 1,79 9 Nonanal 7,73 0,17
10 Cylclohexanol 9,26 0,15 11 Citronellal 9,96 10,41 12 Verbenol 10,51 0,24 13 Terpinen-4-ol 10,76 0,75 14 -Terpineol 11,56 3,34 15 Decanal 12,68 0,32 16 Nerol 13,75 3,69 17 Citronellol 13,99 6,77 18 Neral 14,29 6,9 19 Geraniol 15,04 3,69 20 Geranial 15,6 8,78 21 Citronelly acetate 18,53 0,28 22 Neryl acetate 18,88 0,42 23 Geranyl acetate 19,49 0,48 24 -Caryophyllene 20,06 4,25 25 tran--Bergamotene 20,72 0,57 26 -Caryophyllene 21,02 0,52 27 Germacrene D 21,83 0,24 28 Bicyclogermacrene 22,27 0,21 29 -Bisabolene 22,76 0,83 30 (E,E)--Farnesene 22,85 1,4 31 -Cadinene 23,07 0,14 32 Elemol 23,75 0,13 33 Caryophyllene oxide 24,44 0,43 Tổng 96,29
Từ 2 bảng kết quả phân tích GC – MS ở trên cho thấy cấu tử chính trong