2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu độc tính cấp, bán trƣờng diễn và tác dụng hạ đƣờng huyết theo đƣờng uống của cao lỏng “TVGĐP” trên động vật thực nghiệm
2.3.1.1. Phương pháp xác định độc tính cấp
Độc tính cấp LD50 của bài thuốc TVGĐP đƣợc xác định trên chuột nhắt trắng theo đƣờng uống bằng phƣơng pháp Litchfield - Wilcoxon theo quy định của Bộ Y tế [7] và WHO [87], đƣợc thực hiện tại bộ môn Dƣợc lý, trƣờng đại học Y Hà Nội.
Cô đặc dịch chiết (01 thang TVGĐP chiết 2 lần = 384ml) thành cao lỏng đạt tỷ lệ 3:1 (3 gam dƣợc liệu:1 ml) là thể tích đặc nhất có thể cho chuột uống bằng kim đầu tù chuyên dụng.
60 chuột nhắt trắng đƣợc chia làm 6 lô (mỗi lô 10 chuột). Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Từng lô chuột nhắt trắng, đƣợc uống mẫu thuốc nghiên cứu theo liều tăng dần bắt đầu từ liều 45g dƣợc liệu/kg thể trọng/24 giờ đến liều cao nhất chuột có thể uống đƣợc 225g dƣợc liệu/kg thể trọng/24 giờ (ở các liều khác nhau có thể cho chuột uống 2 hoặc 3 lần để đạt đƣợc thể tích tối đa có thể uống đƣợc trong 24 giờ). Tìm liều cao nhất không gây chết chuột (0 %), liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn (100 %) và các liều trung gian. Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lƣợng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử. Tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc nghiên cứu.
2.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Độc tính bán trƣờng diễn của TVGĐP đƣợc xác định trên thỏ bằng đƣờng uống theo quy định của Bộ Y tế [7], tại bộ môn Dƣợc lý, trƣờng đại học Y Hà Nội.
59
- Lô đối chứng: uống nƣớc cất 8,0 ml/kg/ngày x 12 tuần.
- Lô nghiên cứu 1: uống cao lỏng TVGĐP liều 11,52 g/kg/ngày x 12 tuần (liều có tác dụng tương đương liều dùng trên người, tính theo hệ số 3).
- Lô nghiên cứu 2: uống cao lỏng TVGĐP liều 34,56 g/kg/ngày x 12 tuần (gấp 3 lần lô nghiên cứu 1).
Các chỉ số theo dõi trong quá trình nghiên cứu:
+ Mức tiêu thụ thức ăn, khả năng hoạt động, tình trạng phân, lông. + Trọng lƣợng cơ thể.
+ Các chỉ số huyết học: số lƣợng hồng cầu (T/l), số lƣợng bạch cầu (G/l), số lƣợng tiểu cầu (G/l), công thức bạch cầu, hematocrit (%) và hàm lƣợng hemoglobin (g/l).
+ Các chỉ số hóa sinh máu: hàm lƣợng albumin (g/l), cholesterol, chức năng gan (hoạt độ các enzym AST: Aspartat amino transferase; ALT: Alanin amino transferase; bilirubin) và chức năng thận (hàm lƣợng ure và creatinin).
+ Cấu trúc đại thể và vi thể của gan và thận.
2.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose và lipid máu của cao lỏng TVGĐP trên chuột nhắt trắng thực nghiệm
* Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose và lipid máu của TVGĐP trên chuột nhắt trắng ĐTĐ typ 2 thực nghiệm
Chuột nhắt trắng gây béo phì và ĐTĐ bằng chế độ ăn giàu năng lƣợng từ chất béo và fructose trong 12 tuần. Chuột thí nghiệm đƣợc chia làm 5 lô, mỗi lô có 10 chuột:
- Lô 1: lô chứ + uống nƣớc cất
- Lô 2: c + uống nƣớc cất
- Lô 3: c + uống gliclazid liều 30mg/kg
- Lô 4: c + uống TVGĐP liều 38,4g/kg
60
Sau 12 tuần ăn chế độ NFD và HFD, các lô chuột đƣợc uống nƣớc cất và các thuốc liên tục trong 20 ngày. Tiến hành cân kiểm tra trọng lƣợng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm trƣớc, sau 12 tuần gây mô hình và sau 20 ngày uống thuốc. Vào ngày đầu tiên của nghiên cứu, sau 12 tuần gây mô hình và sau 20 ngày uống thuốc, chuột trong các lô cho nhịn ăn qua đêm. Lấy máu ngoại vi tiến hành định lƣợng glucose máu lúc đói và các chỉ số lipid máu (cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), HDL-Cholesterol, LDL-Cholesterol).
* Phương pháp nghiên cứu tác dụng điều trị dự phòng ĐTĐ typ 2 của TVGĐP trên chuột nhắt trắng thực nghiệm
Chuột nhắt trắng đƣợc chia làm 5 lô, mỗi lô có 10 chuột, các lô đƣợc ăn chế độ HFD đồng thời với uống thuốc thử trong 8 tuần nhƣ sau:
- Lô 1 (lô chứng) + uống nƣớc cất
- Lô 2: c + uống nƣớc cất
- Lô 3: c + uống gliclazid liều 30mg/kg
- Lô 4: c + uống TVGĐP liều 38,4g/kg
- Lô 5: c + uống TVGĐP liều 76,8g/kg
Tiến hành cân kiểm tra trọng lƣợng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm trƣớc, sau thí nghiệm hàng tuần. Vào ngày đầu tiên và sau 8 tuần của thí nghiệm, chuột trong các lô cho nhịn ăn qua đêm. Lấy máu ngoại vi và tiến hành định lƣợng glucose máu lúc đói và các chỉ số lipid máu (cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), HDL-Cholesterol, LDL-Cholesterol).
2.3.2. Nghiên cứu tác dụng điều trị của cao lỏng “Thập vị giáng đƣờng phƣơng” trên bệnh nhân đái tháo đƣờng typ 2 mức độ nhẹ