a. Địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ.
b. Thời gian Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 01/2010 đến tháng 5/2010. 3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất a. Nguyên liệu - Nấm Aspergillus niger - Khoai tây b. Hóa chất (một số hóa chất chính) - Pectin táo (DE 70-75% (Fluka)) - Pectin thương mại
- Nước cất, agar, NaCl, cồn - NaOH, acid citric
- Muối NaCl, muối citrate - Glucose
- MgSO4, (NH4)2SO4, KH2PO4
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị
a. Dụng cụ
- Ống nghiệm (đường kính trong: 1,6 cm, thể tích: 20 ml), ống đong, đĩa petri - Bình tam giác 100 ml, beaker, đĩa petri, micropipet, que cấy, bình định mức - Đũa thủy tinh, vải lọc…
b. Thiết bị
- Cân điện tử
- Máy đo pH (713 pH meter, Metrohm Ltd, CH-9101 Herisau, Switzerland) - Bểđiều nhiệt (Julabo, Germany)
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 23
- Tủ cấy vô trùng - Tủủ
- Nồi hấp autoclaved - Cân điện tử (d=0,0001g) - Máy khuấy từ gia nhiệt
- Máy chuẩn độ acid-bazơ (Titrino 785 Metrohm, Thụy Sĩ) - Máy lắc, nồi, bếp ga...
Hình 3.1 Máy khuấy từ gia nhiệt
Hình 3.2 Tủ cấy
Hình 3.4 Thiết bị thanh trùng Autoclave
Hình 3.3 Máy chuẩn độ acid-bazơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 24
Hình 3.7 Máy vortex Hình 3.8 Cân điện tử
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 25
3.2 Nội dung nghiên cứu
Môi trường nuôi vi sinh vật thu pectinase bắt buộc phải có mặt chất cảm ứng pectin. Ngoài ra, tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về cacbon và nitơ có ý nghĩa lớn
đối với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành enzyme. Nitơ tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật. Môi trường có đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết sẽ tích lũy lượng enzyme lớn nhất. Sự thiếu hụt cấu tử này không được bù đắp bằng sự dư thừa cấu tử kia, vì vậy cần phải chọn thành phần môi trường và tỷ lệ các chất dinh dưỡng sao cho thích hợp để tạo điều kiện tối ưu cho việc tổng hợp enzyme là cao nhất.
Tuy nhiên, quá trình tạo enzyme pectinmethylesterase của nấm mốc Aspergillus niger
phụ thuộc vào nhiều yếu tố, mỗi yếu tố có những ảnh hưởng riêng đối với lượng cũng như hoạt tính enzyme tạo thành. Các yếu tố bao gồm mật số vi sinh vật ban đầu, pH môi trường nuôi cấy, thời gian nuôi cấy… có vai trò quyết định hoạt tính của enzyme PME.
Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm mốc Aspergillus niger và điều kiện môi trường nuôi cấy (pH và thời gian) đến khả năng tổng hợp enzyme pectin methyleterase.
- Mục đích:
Xác định mật số nấm mốc Aspergillus niger thích hợp trên một khối lượng mẫu cho quá trình sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase là cao nhất.
Xác định điều kiện môi trường pH nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase từAspergillus niger
Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase từAspergillus niger.
- Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính enzyme pectin methylesterase.
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nhân tố và 3 lần lặp lại. + Nhân tố A: mật số nấm mốc, có 4 mức độ A1: 102 CFU/ml A2: 103 CFU/ml A3: 104 CFU/ml A4: 105 CFU/ml
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 26 B1: 3,0 B2: 3,5 B3: 4,0 B4: 4,5 B5: 5,0
+ Nhân tố C: thời gian nuôi cấy, có 4 mức độ: C1: 64 giờ C2: 88 giờ C3: 112 giờ C4: 136 giờ - Số nghiệm thức: 4 * 5 * 4 = 80 ð Tổng số mẫu thí nghiệm là: 80 * 3 = 240 mẫu - Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị 40ml môi trường nuôi cấy trong bình tam giác 100ml với nồng độ cơ chất cảm ứng pectin (20 g/l), glucose (60 g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), MgSO4 (0,25 g/l) và (NH4)2SO4 (10 g/l) thích hợp, môi trường được pha với dung dịch đệm citrate 0,1M,
điều chỉnh pH môi trường về giá trị B. Tiếp theo, môi trường được thanh trùng ở
121oC, 1-1,5 at trong 20 phút nhằm tiêu diệt các vi sinh vật có trong môi trường, nếu không chúng sẽức chế sự phát triển của giống vi sinh vật mà ta nuôi cấy. Sau khi môi trường được làm nguội, ta tiến hành cấy chủng nấm mốc Aspergillus niger vào với mật số A và tiến hành nuôi cấy trên máy lắc với tốc độ 140 vòng/phút trong thời gian C ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu nhận enzyme và khảo sát hoạt tính PME bằng máy đo Titrino 785 Metrohm - Thụy Sĩ. Kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Plus 4.0.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 27
Qui trình thí nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme pectin methylesterase từ nấm mốc
Aspergillus niger
Giống (Aspergillus niger)
Nhân giống Môi trường nuôi cấy (40ml) Chỉnh pH (B)
Pha loãng Thanh trùng
(Pha loãng mật số A) (1210C, 1-1,5at trong 20 phút)
Làm nguội (30 – 400C)
Cấy giống (Mật số A)
Nuôi cấy (lắc 140 vòng/phút ở nhiệt độ phòng) (Thời gian nuôi cấy C)
Thu nhận chế phẩm enzyme thô
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 28
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm mốc Aspergillus niger ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp pectin methylesterase đến khả năng sinh tổng hợp pectin methylesterase
Bên cạnh ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy, mật số nấm mốc ban đầu có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp PME. Mật số nấm mốc thích hợp sẽ thúc
đẩy quá trình sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy thí nghiệm tiến hành phân tích ảnh hưởng của mật số nấm mốc ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp PME (Bảng 4.1).
Bảng 4.1 Hoạt tính PME trung bình theo mật số nấm mốc ban đầu
Mật số nấm mốc (CFU/ml) Hoạt tính PME trung bình (U/ml )
102 0,43 c
103 0,49 c
104 2,11 b
105 2,93 a
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Giá trị hoạt tính trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại
Số liệu từBảng 4.1 cho thấy hoạt tính PMEthay đổi theo mật số nấm mốc Aspergillus niger ban đầu và hoạt tính PME tăng dần khi mật số nấm mốc tăng từ 102 đến 105 CFU/ml. Những mẫu có mật số ban đầu 105 CFU/ml cho hoạt tính cao nhất (2,93 U/ml)và khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% với các mẫu có mật số nấm mốc khác. Các mẫu có mật số nấm ban đầu 102 và 103 CFU/ml thì PME thu được có hoạt tính thấp nhất (lần lượt là 0,43và 0,49 U/ml) và hai mật số này không có sự khác biệt ý nghĩa, nhưng lại khác biệt với các mẫu còn lại (ở mức ý nghĩa 5%). Khi mật số nấm mốc ban
đầu thấp, dẫn đến sự gia tăng sinh khối thấp, không đủđể sinh tổng hợp enzyme nên làm giảm lượng enzyme sinh ra. Ngược lại, mật số nấm mốc ban đầu cao nên sinh khối tăng mạnh làm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme. Tuy nhiên, với sự tăng sinh khối mạnh nhưng môi trường nuôi cấy không đáp ứng đủ nhu cầu về dinh dưỡng thì sẽ
làm giảm lượng enzyme sinh ra. Ngoài ra, nhu cầu dinh dưỡng dư so với nhu cầu của nấm mốc đôi khi gây ra tình trạng co nguyên sinh, do nồng độ chất khô hòa tan cao làm tế bào nấm mốc mất nhiều nước, khả năng sinh enzyme giảm. Do đó, khi chủng nấm mốc với mật số ban đầu thích hợp thì sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc ở
mức phù hợp để tổng hợp PME có hoạt tính cao nhất. Kết quả thí nghiệm cho thấy, mật số nấm mốc ban đầu 105 CFU/ml thích hợp nhất cho nấm mốc sinh tổng hợp PME có hoạt tính cao.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 29
4.2 Kết quả khảo sát pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp pectin methylesterase tổng hợp pectin methylesterase
Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp của nấm mốc một cách không giống nhau. Ở giá trị pH thích hợp nấm mốc sẽ phát triển và gia tăng mật số nhanh chóng nên sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase có hoạt tính cao, ngoài ra có những pH mà ởđó nấm mốc không phát triển được hay vẫn phát triển bình thường nhưng các sản phẩm tạo ra ít hoặc không tạo thành. Nấm mốc thích hợp phát triển trong môi trường acid yếu (Lê Xuân Phương, 2007). Do đó, thí nghiệm tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của việc thay đổi pH trong môi trường nuôi cấy ở các mức độ
pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 và 5,0 kết hợp với thay đổi mật số và thời gian nuôi đến khả năng sinh PME từ Aspergillus niger. Kết quả thí nghiệm được tổng hợp và phân tích ở
Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Hoạt tính PME trung bình theo pH môi trường nuôi cấy
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Giá trị hoạt tính trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại
Từ kết quả của Bảng 4.2 cho thấy, với môi trường nuôi cấy có pH 4,0 và 4,5 thu được PME hoạt tính cao nhất (lần lượt là 2,12 U/ml và 2,03U/ml) và không khác biệt ý nghĩa giữa hai giá trị pH này, nhưng có khác biệt (ở mức ý nghĩa 5%) so các giá trị pH còn lại. Môi trường nuôi cấy có pH 3,0; 3,5; 5,0 ta thu được enzyme có hoạt tính thấp hơn; ở các mức pH này có sự khác biệt ý nghĩa (ở mức 5%) và ở pH 3,0 enzyme thu
được có hoạt tính thấp nhất (0,53U/ml).
Vậy môi trường nuôi cấy có pH nằm trong khoảng 4,0 ÷ 4,5 là pH thích hợp cho nấm mốc sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính cao, các mẫu có pH nằm ngoài khoảng pH thích hợp này có hoạt tính enzyme giảm dần. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Lê Xuân Phương (2007) và Nguyễn Đức Lượng (2004).
Theo Lê Xuân Phương (2007), hoạt tính PME giảm dần khi pH môi trường thấp hơn
pH Hoạt tính PME trung bình (U/ml)
3,0 0,53 d
3,5 1,06 c
4,0 2,12 a
4,5 2,03 a
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 30
4,0. Điều này có thể giải thích do vai trò của ion H+ nằm trong thành phần môi trường làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, tùy theo mức độ của chúng mà làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào nấm mốc.
Ngoài ra, khi sử dụng amoni sulfat ((NH4)2SO4) làm nguồn cung cấp nitơ cho nấm mốc cũng ảnh hưởng đến pH của môi trường, các ion amoni (NH4)+ được cơ thể vi sinh vật sử dụng nhiều còn lại các gốc anion vô cơ (SO4)2- sẽ gây acid hóa môi trường (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trong môi trường nuôi cấy có nồng độ glucose cao cũng thường làm cho môi trường chuyển dần về phía acid vì trong quá trình trao đổi chất vi sinh vật tạo nhiều aciad hữu cơ (Lương Đức Phẩm, 1998). Khi pH của môi trường dịch về phía acid thấp hơn 4,0 nấm mốc sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính thấp. Vì vậy, ở một giá trị pH nhất định thì khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm mốc là tối ưu. Kết quả của Bảng 4.2 cho thấy, khi pH môi trường lớn 4,0 thì hoạt tính enzyme giảm dần. Trong khoảng pH 4,5 ÷ 5,0 sự hình thành bào tử và giai đoạn tăng trưởng của nấm mốc không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme bị kìm hãm (Nguyễn Đức Lượng, 2004) nên enzyme tạo thành có hoạt tính không cao.
Kết quả này cũng phù hợp với báo cáo của Vinod và cộng sự (2006) nghiên cứu ởđiều kiện lên men chìm, pH 4,0 là thông số tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzyme pectinase của nấm mốc Aspergillus niger.
4.3 Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp pectin methylesterase pectin methylesterase
Ngoài các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme sinh ra như mật số nấm mốc ban
đầu, pH môi trường thì thời gian nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quan trọng quyết định hoạt tính enzyme cao hay thấp, do hoạt tính enzyme phụ thuộc vào sự sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm mốc. Vì vậy, thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các thời gian nuôi cấy khác nhau đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase được tiến hành. Kết quảđược tổng hợp và phân tích ởBảng 4.3.
Bảng 4.3 Hoạt tính PME trung bình theo thời gian nuôi cấy
Thời gian (giờ) Hoạt tính PME trung bình (U/ml)
64 1,25 b
88 1,56 a
112 1,61 a
136 1,54 a
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 31
Kết quả Bảng 4.3 cho thấy, hiệu quả thu nhận enzyme tăng dần theo thời gian nuôi. Sau thời gian nuôi cấy 88 giờ, 112 giờ và 136 giờ hoạt tính enzyme PME thu được là cao nhất (lần lượt là 1,56, 1,61và 1,54U/ml) và không khác biệt ý nghĩa ở mức 5% .
Ở 64 giờ, hoạt tính enzyme thấp nhất (1,25U/ml), và khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% so với mẫu ở các thời gian khác. Thời gian nuôi cấy là nhân tố quyết định hoạt tính enzyme cao hay thấp, do hoạt tính enzyme thu được phụ thuộc vào sự phát triển của tế bào nấm mốc. Ứng với thời gian nuôi 64 giờ, nấm mốc Aspergillus niger ở giai
đoạn bắt đầu thích nghi với điều kiện môi trường nên chúng chưa tăng mật số đáng kể, quá trình sinh tổng hợp enzyme đang ở giai đoạn khởi đầu nên hiệu suất và hoạt tính PME thu được thấp. Ứng với thời gian 88 giờ nấm mốc ở giai đoạn tăng trưởng mạnh chúng hoàn toàn thích nghi với điều kiện môi trường sự gia tăng mật sốở mức tối đa đồng thời việc tổng hợp enzyme cũng tăng và là thời điểm tốt thu chế phẩm enzyme.
Ngoài ra, để thu được enzyme hoạt tính cao nhất người ta thường ngưng ở thời kỳ
nấm mốc mới bắt đầu tạo bào tử, ở thời kỳ này bào tửđã già hoạt tính enzyme thường giảm rõ rệt (Nguyễn Đức Lượng, 2001).
Nếu thời gian kéo dài nấm mốc sẽ chuyển sang giai đoạn suy vong, số bào tử chết đi lớn hơn số bào tử mới hình thành trong điều kiện cơ chất đã cạn kiệt nên không thể
tăng trưởng được nữa (Lê Xuân Phương, 2007). Do đó nếu tiếp tục kéo dài thời gian nuôi cấy nấm mốc không còn khả năng sinh enzyme theo mong muốn làm hoạt tính PME có xu hướng giảm.
Ở mức thời gian 112 giờ hoạt tính enzyme tăng không đáng kể. Do mục đích kinh tế
nên rút ngắn thời gian nuôi để giảm chi phí. Vì vậy, thời gian nuôi cấy 88 giờ là thích hợp nhất.
Hình 4.1 Mẫu sau khi thanh trùng Hình 4.2 Chế phẩm enzyme thô
Hình 4.1 và Hình 4.2 thể hiện sự thay đổi của các mẫu sau khi thanh trùng qua khoảng thời gian nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger thu được chế phẩm enzyme thô.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 32
4.4 Kết quả tổng hợp ảnh hưởng của mật số nấm mốc Aspergillus niger và điều kiện môi trường nuôi cấy (pH và thời gian) đến khả năng tổng hợp PME kiện môi trường nuôi cấy (pH và thời gian) đến khả năng tổng hợp PME
Quá trình sinh tổng hợp PME của Aspergillus niger phụ thuộc vào nhiều yếu tố, mỗi yếu tố có những ảnh hưởng riêng đối với lượng cũng như hoạt tính enzyme tạo thành.
Bảng 4.4 thể hiện ảnh hưởng của từng yếu tố và sự tương tác của các yếu tố đó đến quá trình sinh tổng hợp enzyme.
Bảng 4.4 Hoạt tính PME trung bình theo mật số nấm mốc ban đầu, pH và thời gian nuôi cấy
Mật số (CFU/ml) pH Thời gian (giờ) Mẫu Hoạt tính PME trung bình (U/ml)
64 1 0,51qr 88 2 0,58 pqr 112 3 0,63 opqr 3,0 136 4 0,29 r 64 5 0,38 r 88 6 0,36 r 112 7 0,51 qr 3,5 136 8 0,36 r 64 9 0,48 qr 88 10 0,33 r 112 11 0,39 r 4,0 136 12 0,41 r 64 13 0,35 r 88 14 0,28 r 112 15 0,43 qr 4,5 136 16 0,39 qr 64 17 0,24 r 88 18 0,47 qr 112 19 0,53 qr 102 5,0 136 20 0,57 pqr 64 21 0,72 opqr 88 22 0,43 qr 112 23 0,55 qr 3,0 136 24 0,51 qr 64 25 0,55 pqr 88 26 0,36 r 112 27 0,63 opqr 3,5 136 28 0,45 qr