- Ép chiết dịch quả: làm tăng hiệu suất thu hồi dịch quả. Sự phân hủy một phần tế bào quả bởi enzyme tạo thuận lợi cho việc tách chiết các chất màu, chất thơm và góp phần vào cải thiện chất lượng của dịch quả. Hoạt động chính của enyme giúp quá trình ép là thủy phân các khung xương chính của pectin, tức là endo-polygalacturonase, pectin methylesterase và pectinlyase. Sự có mặt của pectinase trong quá trình ép sẽ làm tăng hiệu suất thu hồi dịch ép lên 15-25%. (Đặng Thị Thu et al., 2004)
- Ngâm dầm và ổn định nectar: nectar là loại nước uống, mà nước quả nhớt chứa một lượng lớn các chất ở dạng huyền phù. Độđục này chủ yếu là do các tế bào được chiết ra và các tập hợp tế bào. Sự phân tán tế bào này nhận được do sự phân hủy pectin có
độ metoxy hóa thấp của các lát mỏng trung bình bởi endogalacturonase. (Đặng Thị
Thu et al., 2004)
- Dịch hóa: ngược với ngâm dầm, dịch hóa đòi hỏi có sự phân hủy hoàn toàn của màng tế bào. Các enzyme pectin methylesterase, hemicellulase và cellulase là những enzyme quyết định hiệu quả của chế phẩm, vì chúng làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt tốt hơn. (Đặng Thị Thu et al., 2004).
- Lên men cà phê và ca cao cũng là một lĩnh vực ứng dụng nhiều triển vọng của enzyme pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong quá trình lên men, lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bị phân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khô (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
- Làm trong: loại bỏ các chất pectin có thểđược thực hiện bằng cách kết tủa hay thủy phân. Trường hợp kết tủa, enzyme thuần khiết pectin metylesterase được sử dụng kết hợp với việc bổ sung ion canxi kéo theo sự tạo thành các gel canxi pectat, tạo nên cái bẫy để kéo theo các phần tử gây đục. Các gel này co lại và lắng trong dịch quả, hay ngược lại chúng nổi lên bề mặt khi lên men do tác dụng của CO2: đây là trường hợp sản xuất nước quả lên men độ rượu thấp. Làm trong bằng tác dụng kết hợp giữa enzyme pectin methylesterase và polygalacturonase. Các phần tửđục được tạo nên từ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 20
protein liên kết với các pectin thường có mạch bên giàu arabinan và galactan. Ở pH của dịch quả các protein này tích điện dương và bao quanh nó là các pectin tích điện âm. Phân hủy pectin sẽ giải phóng ra một phần protein tích điện dương và pectin tích
điện âm. Chính vì vậy các phần tử này kết lắng bởi tương tác tĩnh điện với nhau và dịch quảđược làm trong. (Đặng Thị Thu et al., 2004).
Các chế phẩm enzyme được sử dụng là: Pectinex Ultra SP-L (xử lý quả nghiền và ngâm mô tế bào thực vật), Pectinex 3XL và Pectinex AR (làm trong nước quả), Viscozyme 120L (phá vỡ màng tế bào đậu tương)… (Đặng Thị Thu et al., 2004)
2.8.2 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác
Trong công nghiệp dệt, nhuộm
Pectin nằm ở bên ngoài của xơ bông, nó là một chất keo chứa các acid polygalacturonic và thường được chuyển sang các dạng muối canxi, magie, sắt, và cả
nhôm trong quá trình phát triển của xơ bông. Các muối pectin không tan trong nước này kết dính với sáp và protein tạo ra “tấm chắn” bảo vệ xơ trong quá trình trưởng thành. Thủy phân pectin bằng các pectinase, biến các muối không tan thành các sản phẩm hòa tan trong nước, như vậy phá vỡ có hiệu quả “tấm chắn”, đạt được mức độ
hút nước cao mà không có hiệu ứng phụ bất lợi phân giải cellulose. Hiện nay trên thị
trường đã có bán loại enzyme kiềm tính với tính thương mại là BioPrep 3000L (Novozymes AS, Đan Mạch) và Baysolex VP-SP 20022 (Bayer, Đức). (Đặng Thị Thu
et al., 2004)
- Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong quá trình nghiền bột hoá học, nếu gỗ được xử lý trước với một số enzyme như
hemicellulase, pectinase và cellulase làm cho lớp vỏ ngoài của gỗ bị phá vỡ tăng khả
năng khuếch tán các hóa chất vào phía trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin. (Đặng Thị
Thu et al., 2004)
- Trong trích ly các dược liệu đông y
Sắc thuốc là nhằm mục đích trích ly các hoạt chất ở trong dược liệu ra. Song do có pectin nên làm cho quá trình trích ly khó khăn, không trích ly hết được hoặc dịch trích ly bị đục sau một số ngày. Để tiết kiệm công sức tránh phiền phức và tổn thất khi sắc thuốc, đồng thời trích ly được triệt để và tạo khả năng pha chế thuốc theo đơn, người ta có thể dùng chế phẩm pectinase. Dưới tác dụng của phức hệ pectinase, pectin bị
phân giải, mô thực vật bị phá hủy do đó các hoạt chất được giải phóng ra dễ dàng. - Ứng dụng trong chăn nuôi
Khẩu phần thức ăn của động vật thường có hàm lượng pectin, cellulose và hemicellulose cao. Tuy nhiên, dịch tiêu hóa động vật cũng không có hemicellulose để
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 21
chất phức tạp khác. Để giúp động vật sử dụng triệt để thức ăn, người ta phải thêm vào khẩu phần ăn của chúng các chế phẩm enzyme nguồn vi sinh vật có hoạt độ pectinase cùng với cellulase và hemicellulase cao. (Lê Ngọc Tú et al., 1982)
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 22
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
a. Địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ.
b. Thời gian Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 01/2010 đến tháng 5/2010. 3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất a. Nguyên liệu - Nấm Aspergillus niger - Khoai tây b. Hóa chất (một số hóa chất chính) - Pectin táo (DE 70-75% (Fluka)) - Pectin thương mại
- Nước cất, agar, NaCl, cồn - NaOH, acid citric
- Muối NaCl, muối citrate - Glucose
- MgSO4, (NH4)2SO4, KH2PO4
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị
a. Dụng cụ
- Ống nghiệm (đường kính trong: 1,6 cm, thể tích: 20 ml), ống đong, đĩa petri - Bình tam giác 100 ml, beaker, đĩa petri, micropipet, que cấy, bình định mức - Đũa thủy tinh, vải lọc…
b. Thiết bị
- Cân điện tử
- Máy đo pH (713 pH meter, Metrohm Ltd, CH-9101 Herisau, Switzerland) - Bểđiều nhiệt (Julabo, Germany)
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 23
- Tủ cấy vô trùng - Tủủ
- Nồi hấp autoclaved - Cân điện tử (d=0,0001g) - Máy khuấy từ gia nhiệt
- Máy chuẩn độ acid-bazơ (Titrino 785 Metrohm, Thụy Sĩ) - Máy lắc, nồi, bếp ga...
Hình 3.1 Máy khuấy từ gia nhiệt
Hình 3.2 Tủ cấy
Hình 3.4 Thiết bị thanh trùng Autoclave
Hình 3.3 Máy chuẩn độ acid-bazơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 24
Hình 3.7 Máy vortex Hình 3.8 Cân điện tử
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 25
3.2 Nội dung nghiên cứu
Môi trường nuôi vi sinh vật thu pectinase bắt buộc phải có mặt chất cảm ứng pectin. Ngoài ra, tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về cacbon và nitơ có ý nghĩa lớn
đối với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành enzyme. Nitơ tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật. Môi trường có đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết sẽ tích lũy lượng enzyme lớn nhất. Sự thiếu hụt cấu tử này không được bù đắp bằng sự dư thừa cấu tử kia, vì vậy cần phải chọn thành phần môi trường và tỷ lệ các chất dinh dưỡng sao cho thích hợp để tạo điều kiện tối ưu cho việc tổng hợp enzyme là cao nhất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tuy nhiên, quá trình tạo enzyme pectinmethylesterase của nấm mốc Aspergillus niger
phụ thuộc vào nhiều yếu tố, mỗi yếu tố có những ảnh hưởng riêng đối với lượng cũng như hoạt tính enzyme tạo thành. Các yếu tố bao gồm mật số vi sinh vật ban đầu, pH môi trường nuôi cấy, thời gian nuôi cấy… có vai trò quyết định hoạt tính của enzyme PME.
Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm mốc Aspergillus niger và điều kiện môi trường nuôi cấy (pH và thời gian) đến khả năng tổng hợp enzyme pectin methyleterase.
- Mục đích:
Xác định mật số nấm mốc Aspergillus niger thích hợp trên một khối lượng mẫu cho quá trình sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase là cao nhất.
Xác định điều kiện môi trường pH nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase từAspergillus niger
Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase từAspergillus niger.
- Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính enzyme pectin methylesterase.
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nhân tố và 3 lần lặp lại. + Nhân tố A: mật số nấm mốc, có 4 mức độ A1: 102 CFU/ml A2: 103 CFU/ml A3: 104 CFU/ml A4: 105 CFU/ml
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 26 B1: 3,0 B2: 3,5 B3: 4,0 B4: 4,5 B5: 5,0
+ Nhân tố C: thời gian nuôi cấy, có 4 mức độ: C1: 64 giờ C2: 88 giờ C3: 112 giờ C4: 136 giờ - Số nghiệm thức: 4 * 5 * 4 = 80 ð Tổng số mẫu thí nghiệm là: 80 * 3 = 240 mẫu - Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị 40ml môi trường nuôi cấy trong bình tam giác 100ml với nồng độ cơ chất cảm ứng pectin (20 g/l), glucose (60 g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), MgSO4 (0,25 g/l) và (NH4)2SO4 (10 g/l) thích hợp, môi trường được pha với dung dịch đệm citrate 0,1M,
điều chỉnh pH môi trường về giá trị B. Tiếp theo, môi trường được thanh trùng ở
121oC, 1-1,5 at trong 20 phút nhằm tiêu diệt các vi sinh vật có trong môi trường, nếu không chúng sẽức chế sự phát triển của giống vi sinh vật mà ta nuôi cấy. Sau khi môi trường được làm nguội, ta tiến hành cấy chủng nấm mốc Aspergillus niger vào với mật số A và tiến hành nuôi cấy trên máy lắc với tốc độ 140 vòng/phút trong thời gian C ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu nhận enzyme và khảo sát hoạt tính PME bằng máy đo Titrino 785 Metrohm - Thụy Sĩ. Kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Plus 4.0.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 27
Qui trình thí nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme pectin methylesterase từ nấm mốc
Aspergillus niger
Giống (Aspergillus niger)
Nhân giống Môi trường nuôi cấy (40ml) Chỉnh pH (B)
Pha loãng Thanh trùng
(Pha loãng mật số A) (1210C, 1-1,5at trong 20 phút)
Làm nguội (30 – 400C)
Cấy giống (Mật số A)
Nuôi cấy (lắc 140 vòng/phút ở nhiệt độ phòng) (Thời gian nuôi cấy C)
Thu nhận chế phẩm enzyme thô
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 28
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm mốc Aspergillus niger ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp pectin methylesterase đến khả năng sinh tổng hợp pectin methylesterase
Bên cạnh ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy, mật số nấm mốc ban đầu có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp PME. Mật số nấm mốc thích hợp sẽ thúc
đẩy quá trình sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy thí nghiệm tiến hành phân tích ảnh hưởng của mật số nấm mốc ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp PME (Bảng 4.1). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 4.1 Hoạt tính PME trung bình theo mật số nấm mốc ban đầu
Mật số nấm mốc (CFU/ml) Hoạt tính PME trung bình (U/ml )
102 0,43 c
103 0,49 c
104 2,11 b
105 2,93 a
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Giá trị hoạt tính trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại
Số liệu từBảng 4.1 cho thấy hoạt tính PMEthay đổi theo mật số nấm mốc Aspergillus niger ban đầu và hoạt tính PME tăng dần khi mật số nấm mốc tăng từ 102 đến 105 CFU/ml. Những mẫu có mật số ban đầu 105 CFU/ml cho hoạt tính cao nhất (2,93 U/ml)và khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% với các mẫu có mật số nấm mốc khác. Các mẫu có mật số nấm ban đầu 102 và 103 CFU/ml thì PME thu được có hoạt tính thấp nhất (lần lượt là 0,43và 0,49 U/ml) và hai mật số này không có sự khác biệt ý nghĩa, nhưng lại khác biệt với các mẫu còn lại (ở mức ý nghĩa 5%). Khi mật số nấm mốc ban
đầu thấp, dẫn đến sự gia tăng sinh khối thấp, không đủđể sinh tổng hợp enzyme nên làm giảm lượng enzyme sinh ra. Ngược lại, mật số nấm mốc ban đầu cao nên sinh khối tăng mạnh làm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme. Tuy nhiên, với sự tăng sinh khối mạnh nhưng môi trường nuôi cấy không đáp ứng đủ nhu cầu về dinh dưỡng thì sẽ
làm giảm lượng enzyme sinh ra. Ngoài ra, nhu cầu dinh dưỡng dư so với nhu cầu của nấm mốc đôi khi gây ra tình trạng co nguyên sinh, do nồng độ chất khô hòa tan cao làm tế bào nấm mốc mất nhiều nước, khả năng sinh enzyme giảm. Do đó, khi chủng nấm mốc với mật số ban đầu thích hợp thì sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc ở
mức phù hợp để tổng hợp PME có hoạt tính cao nhất. Kết quả thí nghiệm cho thấy, mật số nấm mốc ban đầu 105 CFU/ml thích hợp nhất cho nấm mốc sinh tổng hợp PME có hoạt tính cao.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 29
4.2 Kết quả khảo sát pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp pectin methylesterase tổng hợp pectin methylesterase
Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp của nấm mốc một cách không giống nhau. Ở giá trị pH thích hợp nấm mốc sẽ phát triển và gia tăng mật số nhanh chóng nên sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase có hoạt tính cao, ngoài ra có những pH mà ởđó nấm mốc không phát triển được hay vẫn phát triển bình thường nhưng các sản phẩm tạo ra ít hoặc không tạo thành. Nấm mốc thích hợp phát triển trong môi trường acid yếu (Lê Xuân Phương, 2007). Do đó, thí nghiệm tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của việc thay đổi pH trong môi trường nuôi cấy ở các mức độ
pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 và 5,0 kết hợp với thay đổi mật số và thời gian nuôi đến khả năng sinh PME từ Aspergillus niger. Kết quả thí nghiệm được tổng hợp và phân tích ở
Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Hoạt tính PME trung bình theo pH môi trường nuôi cấy
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Giá trị hoạt tính trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại
Từ kết quả của Bảng 4.2 cho thấy, với môi trường nuôi cấy có pH 4,0 và 4,5 thu được PME hoạt tính cao nhất (lần lượt là 2,12 U/ml và 2,03U/ml) và không khác biệt ý nghĩa giữa hai giá trị pH này, nhưng có khác biệt (ở mức ý nghĩa 5%) so các giá trị pH còn lại. Môi trường nuôi cấy có pH 3,0; 3,5; 5,0 ta thu được enzyme có hoạt tính thấp hơn; ở các mức pH này có sự khác biệt ý nghĩa (ở mức 5%) và ở pH 3,0 enzyme thu
được có hoạt tính thấp nhất (0,53U/ml).
Vậy môi trường nuôi cấy có pH nằm trong khoảng 4,0 ÷ 4,5 là pH thích hợp cho nấm mốc sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính cao, các mẫu có pH nằm ngoài khoảng pH thích hợp này có hoạt tính enzyme giảm dần. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Lê Xuân Phương (2007) và Nguyễn Đức Lượng (2004).
Theo Lê Xuân Phương (2007), hoạt tính PME giảm dần khi pH môi trường thấp hơn
pH Hoạt tính PME trung bình (U/ml)
3,0 0,53 d
3,5 1,06 c
4,0 2,12 a
4,5 2,03 a
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 30 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4,0. Điều này có thể giải thích do vai trò của ion H+ nằm trong thành phần môi trường làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, tùy theo mức độ của chúng mà làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào nấm mốc.
Ngoài ra, khi sử dụng amoni sulfat ((NH4)2SO4) làm nguồn cung cấp nitơ cho nấm mốc cũng ảnh hưởng đến pH của môi trường, các ion amoni (NH4)+ được cơ thể vi sinh vật sử dụng nhiều còn lại các gốc anion vô cơ (SO4)2- sẽ gây acid hóa môi trường (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trong môi trường nuôi cấy có nồng độ glucose cao cũng thường làm cho môi trường chuyển dần về phía acid vì trong quá trình trao đổi chất vi sinh vật tạo nhiều aciad hữu cơ (Lương Đức Phẩm, 1998). Khi pH của môi trường