Đặc điểm chung của mọi môi trường nuôi vi sinh vật thu pectinase là có mặt chất cảm
ứng: pectin từ vỏ bưởi hoặc từ nguồn khác. Ngoài ra, tỷ lượng giữa carbon và nitơ
trong môi trường, tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối vối sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành enzyme, đồng thời các nguồn khoáng dinh dưỡng phải phù hợp đảm bảo cho sự sinh enzyme ở mức tối ưu.
2.6.2 pH môi trường
Độ pH môi trường có một ý nghĩa rất lớn nên chọn pH phù hợp với chủng vi sinh vật và sự tổng hợp enzyme theo mong muốn. pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của nấm mốc và sự tạo ra enzyme (Trần Xuân Ngạch, 2007). Khoảng pH thích hợp của môi trường nuôi cấy Aspergillus niger sinh PME là 4,0 - 6,5. Khi dùng các muối amonium làm nguồn nitrogen, quá trình phát triển vi sinh vật sẽ acid hóa môi trường; còn khi dùng nitrate làm nguồn nitrogen môi trường sẽ bị kiềm hóa. Khi pH dịch về phía acid hoặc phía kiềm, sự tạo thành sinh khối không bịảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm. (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
2.6.3 Thời gian nuôi
Đối với nấm sợi Aspergillus, sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt tính enzyme (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
Nấm mốc Aspergillus niger được nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu nên giai đoạn sinh trưởng và phát triển kéo dài do nấm mốc khó tiếp xúc với nguồn chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy hơn so với phương pháp bề mặt. Vì vậy, thời gian nuôi cấy tương đối dài, khoảng 72 giờ - 144 giờ. (Vinod Kumar Joshi et al., 2006).
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 17
2.6.4 Nhiệt độ
Nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Nấm mốc Aspergillus niger phát triển thích hợp ở nhiệt độ 28 - 32oC. Nhiệt độ thấp hoặc cao hơn sẽ hạn chế sự sinh trưởng của nấm mốc, đến một mức tới hạn nào đó sẽức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm mốc.
2.6.5 Nguồn khoáng dinh dưỡng
Các nguyên tốđa vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật.
Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (acid nucleic phospholipide) và nhiều coenzyme, đồng thời để phosphoril hoá glucid trong quá trình oxy hoá sinh học. Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác
Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme. MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự
tổng hợp enzyme bởi nấm sợi.
Lưu huỳnh kích thích tạo enzyme (S có trong thành phần các acid amin quan trọng như methionine, cystein).
2.6.6 Hàm lượng oxy hòa tan
Trong phương pháp nuôi cấy chìm nhằm đáp ứng nhu cầu oxy trong trong quá trình nuôi cấy cần có sự khấy trộn làm tăng lượng oxy hòa tan vào môi trường nuôi cấy cung cấp cho nấm mốc. Việc xáo trộn môi trường nuôi cấy làm các thành phần môi trường và các tế bào vi sinh vật không lắng nhằm làm tăng khả năng tiếp xúc của vi sinh vật và thành phần môi trường, từ đó làm tăng khả năng trao đổi chất của trao đổi chất của vi sinh vật góp phần làm tăng lượng enzyme tổng hợp. Mặt khác, khuấy trộn làm tăng khả năng hòa tan oxy không khí vào trong môi trường (Nguyễn Đức Lượng
et al., 2004).
2.7 Một số nghiên cứu về sản xuất enzyme pectin methylesterase
Xia jin-lan et al. (2009) nghiên cứu định danh và tối ưu hóa điều kiện lên men protopectinase từ Aspergillus niger cho sản phẩm pectin đã chỉ ra rằng: để pectinase có hoạt tính cao thì ở giá trị pH 5, nhiệt độủ 300C, thời gian nuôi cấy 36 giờ và nguồn nitrogen NH4Cl là điều kiện nuôi cấy tối ưu.
Patil et al. (2006) đã nghiên cứu sản xuất enzyme pectinase từ dầu hoa hướng dương
đã bóc vỏ bằng Aspergillus nigerởđiều kiện lên men chìm và lên men rắn và kết luận rằng: ở môi trường có bổ sung 4% glucose (đối với lên men chìm), 6% sacharose (đối với lên men rắn), và 0,3% amonium sulphate thì thu được lượng enzyme pectinase cao hơn.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 18
Vinod Kumar Joshi và cộng sự (2006) nghiên cứu sản xuất enzyme pectin methylesterase từ thịt quả táo ở điều kiện lên men chìm và lên men rắn đã kết luận rằng giá trị pH 4, nhiệt độủ 250C và thời gian nuôi cấy 96 giờ là điều kiện nuôi cấy tối ưu ở cả 2 điều kiện lên men. 0,2% amonium sulphate và 0,5% sodium chloride bổ
sung vào môi trường lên men rắn sẽ thu được sản lượng PME cao nhất. Nhìn chung, thì hoạt tính PME ởđiều kiện lên men rắn cao gấp 2,3 lần so với lên men chìm.
Sarvamangala và Dayanand (2005) khảo sát pectinase từ Aspergillus niger từ phế
phẩm nông nghiệp cho thấy hoạt tính pectinase tăng khi bổ sung nguồn cacbon và nitơ. Đối với phương pháp lên men rắn thì bổ sung sacharose (hoạt tính enzyme cao nhất ở 8% sacharose) sẽ hiệu quả hơn glucose (hoạt tính enzyme cao nhất ở 6% glucose). Nhưng đối với phương pháp lên men chìm thì bổ sung glucose (6%) sẽ cho enzyme có hoạt tính cao hơn.
Bai Z.H. et al. (2004) với nghiên cứu việc sản xuất pectinase từ Aspergillus niger
bằng nước thải ở điều kiện lên men rắn để suy ra khả năng chống chịu bệnh của cây trồng đã đưa ra kết luận về thành phần của môi trường lên men là 11 ml nước thải từ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sản xuất bột ngọt đã được cô đặc (chứa NH3-N 38.2mg/ml), 10g củ cải đường, 0,2g Na2HPO4.12H2O, 0,04g KH2PO4 và ủ ở 30oC thì sẽ thu được lượng enzyme pectinase cao nhất sau 96 giờ nuôi cấy.
Theo Fawole và Odunfa (2003), một số nhân tố ảnh hưởng đến việc tổng hợp enzyme polygalacturonase và pectin methylesterase bởi Aspergillus niger là hàm lượng acid galacturonic và pectin trong môi trường nuôi cấy, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy, cùng với giá trị pH của môi trường. Các tác giả cũng đưa ra kết luận là amonium sulphate là nguồn nitrogen tốt nhất cho việc tổng hợp cả 2 loại enzyme trên, điều kiện nuôi cấy tốt nhất ở 400C, pH 5 và thời gian 4 ngày.
Maria và cộng sự (2000) nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sản phẩm pectinase từ Aspergillus japonicus 586 cho thấy hoạt tính của pectinesterase đạt cao nhất khi bổ sung 0,5% (w/v) pectin, và hoạt tính của enzyme sẽ giảm khi bổ sung pectin, glucose and saccharose với nồng độ cao.
Maldonado và Strasser de Saad (1998) nghiên cứu sản xuất pectinesterase và polygalacturonase từ Aspergillus niger ở điều kiện lên men rắn và lên men chìm đã kết luận rằng: với pectin như nguồn cacbon duy nhất thì trong điều kiện lên men rắn hoạt tính của pectinesterase sẽ cao hơn 4 lần và của polygalacturonase sẽ cao hơn 6 lần so với lên men chìm. Khi thêm glucose thì pectinesterase và polygalacturonase sẽ
tăng ở điều kiện lên men rắn, nhưng ở lên men chìm thì sản phẩm bị ức chế rõ rệt. Môi trường lên men chìm (g/l) tối ưu: KH2PO4: 4; Na2HPO4: 0,2; FeSO4. 7H2O: 0,2; CaCl2: 0,01; (NH4)2PO4:2; MnSO4. 7H2O: 0,07; H3BO3: 0,01; pectin: 15. Môi trường
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 19
được thanh trùng ở 120 0C trong 15 phút với pH 4,5 và chủng 2.106 cfu/ml Aspergillus niger.
Theo Solís-Pereira và cộng sự (1993), việc sản xuất enzyme endo-pectinase và exo- pectinase bằng phương pháp lên men rắn sẽ không giảm khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến 10% glucose, sacharose hoặc acid galactorunic. Hơn nữa hoạt tính của 2 loại enzyme trên sẽ tăng khi nồng độ của nguồn cacbon tăng. Hoạt tính của endo- pectinase và exo-pectinase ởđiều kiện lên men rắn sẽ cao hơn từ 3 đến 11 lần so với ở điều kiện lên men chìm.
2.8 Ứng dụng của enzyme pectin methylesterase
2.8.1 Ứng dụng trong chế biến thực phẩm
- Ép chiết dịch quả: làm tăng hiệu suất thu hồi dịch quả. Sự phân hủy một phần tế bào quả bởi enzyme tạo thuận lợi cho việc tách chiết các chất màu, chất thơm và góp phần vào cải thiện chất lượng của dịch quả. Hoạt động chính của enyme giúp quá trình ép là thủy phân các khung xương chính của pectin, tức là endo-polygalacturonase, pectin methylesterase và pectinlyase. Sự có mặt của pectinase trong quá trình ép sẽ làm tăng hiệu suất thu hồi dịch ép lên 15-25%. (Đặng Thị Thu et al., 2004)
- Ngâm dầm và ổn định nectar: nectar là loại nước uống, mà nước quả nhớt chứa một lượng lớn các chất ở dạng huyền phù. Độđục này chủ yếu là do các tế bào được chiết ra và các tập hợp tế bào. Sự phân tán tế bào này nhận được do sự phân hủy pectin có
độ metoxy hóa thấp của các lát mỏng trung bình bởi endogalacturonase. (Đặng Thị
Thu et al., 2004)
- Dịch hóa: ngược với ngâm dầm, dịch hóa đòi hỏi có sự phân hủy hoàn toàn của màng tế bào. Các enzyme pectin methylesterase, hemicellulase và cellulase là những enzyme quyết định hiệu quả của chế phẩm, vì chúng làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt tốt hơn. (Đặng Thị Thu et al., 2004).
- Lên men cà phê và ca cao cũng là một lĩnh vực ứng dụng nhiều triển vọng của enzyme pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong quá trình lên men, lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bị phân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khô (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
- Làm trong: loại bỏ các chất pectin có thểđược thực hiện bằng cách kết tủa hay thủy phân. Trường hợp kết tủa, enzyme thuần khiết pectin metylesterase được sử dụng kết hợp với việc bổ sung ion canxi kéo theo sự tạo thành các gel canxi pectat, tạo nên cái bẫy để kéo theo các phần tử gây đục. Các gel này co lại và lắng trong dịch quả, hay ngược lại chúng nổi lên bề mặt khi lên men do tác dụng của CO2: đây là trường hợp sản xuất nước quả lên men độ rượu thấp. Làm trong bằng tác dụng kết hợp giữa enzyme pectin methylesterase và polygalacturonase. Các phần tửđục được tạo nên từ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 20
protein liên kết với các pectin thường có mạch bên giàu arabinan và galactan. Ở pH của dịch quả các protein này tích điện dương và bao quanh nó là các pectin tích điện âm. Phân hủy pectin sẽ giải phóng ra một phần protein tích điện dương và pectin tích
điện âm. Chính vì vậy các phần tử này kết lắng bởi tương tác tĩnh điện với nhau và dịch quảđược làm trong. (Đặng Thị Thu et al., 2004).
Các chế phẩm enzyme được sử dụng là: Pectinex Ultra SP-L (xử lý quả nghiền và ngâm mô tế bào thực vật), Pectinex 3XL và Pectinex AR (làm trong nước quả), Viscozyme 120L (phá vỡ màng tế bào đậu tương)… (Đặng Thị Thu et al., 2004)
2.8.2 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác
Trong công nghiệp dệt, nhuộm
Pectin nằm ở bên ngoài của xơ bông, nó là một chất keo chứa các acid polygalacturonic và thường được chuyển sang các dạng muối canxi, magie, sắt, và cả
nhôm trong quá trình phát triển của xơ bông. Các muối pectin không tan trong nước này kết dính với sáp và protein tạo ra “tấm chắn” bảo vệ xơ trong quá trình trưởng thành. Thủy phân pectin bằng các pectinase, biến các muối không tan thành các sản phẩm hòa tan trong nước, như vậy phá vỡ có hiệu quả “tấm chắn”, đạt được mức độ
hút nước cao mà không có hiệu ứng phụ bất lợi phân giải cellulose. Hiện nay trên thị
trường đã có bán loại enzyme kiềm tính với tính thương mại là BioPrep 3000L (Novozymes AS, Đan Mạch) và Baysolex VP-SP 20022 (Bayer, Đức). (Đặng Thị Thu
et al., 2004)
- Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong quá trình nghiền bột hoá học, nếu gỗ được xử lý trước với một số enzyme như (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hemicellulase, pectinase và cellulase làm cho lớp vỏ ngoài của gỗ bị phá vỡ tăng khả
năng khuếch tán các hóa chất vào phía trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin. (Đặng Thị
Thu et al., 2004)
- Trong trích ly các dược liệu đông y
Sắc thuốc là nhằm mục đích trích ly các hoạt chất ở trong dược liệu ra. Song do có pectin nên làm cho quá trình trích ly khó khăn, không trích ly hết được hoặc dịch trích ly bị đục sau một số ngày. Để tiết kiệm công sức tránh phiền phức và tổn thất khi sắc thuốc, đồng thời trích ly được triệt để và tạo khả năng pha chế thuốc theo đơn, người ta có thể dùng chế phẩm pectinase. Dưới tác dụng của phức hệ pectinase, pectin bị
phân giải, mô thực vật bị phá hủy do đó các hoạt chất được giải phóng ra dễ dàng. - Ứng dụng trong chăn nuôi
Khẩu phần thức ăn của động vật thường có hàm lượng pectin, cellulose và hemicellulose cao. Tuy nhiên, dịch tiêu hóa động vật cũng không có hemicellulose để
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 21
chất phức tạp khác. Để giúp động vật sử dụng triệt để thức ăn, người ta phải thêm vào khẩu phần ăn của chúng các chế phẩm enzyme nguồn vi sinh vật có hoạt độ pectinase cùng với cellulase và hemicellulase cao. (Lê Ngọc Tú et al., 1982)
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 22
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
a. Địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ.
b. Thời gian Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 01/2010 đến tháng 5/2010. 3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất a. Nguyên liệu - Nấm Aspergillus niger - Khoai tây b. Hóa chất (một số hóa chất chính) - Pectin táo (DE 70-75% (Fluka)) - Pectin thương mại
- Nước cất, agar, NaCl, cồn - NaOH, acid citric
- Muối NaCl, muối citrate - Glucose
- MgSO4, (NH4)2SO4, KH2PO4
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị
a. Dụng cụ
- Ống nghiệm (đường kính trong: 1,6 cm, thể tích: 20 ml), ống đong, đĩa petri - Bình tam giác 100 ml, beaker, đĩa petri, micropipet, que cấy, bình định mức - Đũa thủy tinh, vải lọc…
b. Thiết bị
- Cân điện tử
- Máy đo pH (713 pH meter, Metrohm Ltd, CH-9101 Herisau, Switzerland) - Bểđiều nhiệt (Julabo, Germany)
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 23
- Tủ cấy vô trùng - Tủủ
- Nồi hấp autoclaved - Cân điện tử (d=0,0001g) - Máy khuấy từ gia nhiệt
- Máy chuẩn độ acid-bazơ (Titrino 785 Metrohm, Thụy Sĩ) - Máy lắc, nồi, bếp ga...
Hình 3.1 Máy khuấy từ gia nhiệt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.2 Tủ cấy
Hình 3.4 Thiết bị thanh trùng Autoclave
Hình 3.3 Máy chuẩn độ acid-bazơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 24
Hình 3.7 Máy vortex Hình 3.8 Cân điện tử
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm 25
3.2 Nội dung nghiên cứu
Môi trường nuôi vi sinh vật thu pectinase bắt buộc phải có mặt chất cảm ứng pectin. Ngoài ra, tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về cacbon và nitơ có ý nghĩa lớn
đối với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành enzyme. Nitơ tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật. Môi trường có đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết sẽ tích lũy lượng enzyme lớn nhất. Sự thiếu hụt cấu tử này không được bù đắp bằng sự dư thừa cấu tử kia, vì vậy cần phải chọn thành phần môi trường và tỷ lệ các chất dinh dưỡng sao cho thích hợp để tạo điều kiện tối ưu cho việc tổng hợp enzyme là cao nhất.
Tuy nhiên, quá trình tạo enzyme pectinmethylesterase của nấm mốc Aspergillus niger
phụ thuộc vào nhiều yếu tố, mỗi yếu tố có những ảnh hưởng riêng đối với lượng cũng như hoạt tính enzyme tạo thành. Các yếu tố bao gồm mật số vi sinh vật ban đầu, pH môi trường nuôi cấy, thời gian nuôi cấy… có vai trò quyết định hoạt tính của enzyme PME.
Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm mốc Aspergillus niger và điều kiện môi trường nuôi cấy (pH và thời gian) đến khả năng tổng hợp enzyme pectin methyleterase.
- Mục đích:
Xác định mật số nấm mốc Aspergillus niger thích hợp trên một khối lượng mẫu cho quá trình sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase là cao nhất.
Xác định điều kiện môi trường pH nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp