1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất
Vỏ tôm, đầu tôm khô còn lại sau quá trình chế biến tôm đông lạnh được thu mua từ Công ty Cổ phần Nuôi trồng thủy sản Thuận Thiện Phát (Số 219 cụm 3 phường Đông Khê, Ngô Quyền, Hải Phòng), được dùng làm nguyên liệu sản xuất chitosan mà không tinh chế thêm.
Các hoá chất thông dụng như NaOH 99%, HCl 37%, KMnO4, axit axetic 100% (glacial), sodium axetat (CH3COONa.2H2O) được mua từ hãng Merck (Đức), sodium tripolyphosphat (s-TPP) 85%, và KBr được mua từ hãng Sigma-Aldrich. Triallyl isocyanurate (TAIC) được mua từ công ty hóa chất Nippon Kasei (Nhật Bản). Thuốc nhuộm Drimaren Red CL-5B (C31H24 Cl N7 O19 S6. 5 Na), với mã số RR241 trong từ điển thuốc nhuộm (Colour Index numbers - CI), được cung cấp bởi hãng Clariant và sử dụng ngay khi nhận mà không xử lý gì thêm. Axit oxalic 98% và một số dung môi thông dụng khác mua từ công ty hóa chất Deajung (Hàn Quốc).
1.2 Thiết bị, dụng cụ
- Máy đo pH model 3310 – Jeway (Anh quốc). - Máy ổn nhiệt JSR Model JSIB-22T (Hàn Quốc).
- Máy khuấy từ gia nhiệt cùng các thanh khuấy từ (Italia).
24
- Máy lắc gia nhiệt Tuhua (China) và Biosan ES-20 (Latvia). - Nhớt kế mao quản Ubbelodhe (Nhật Bản).
- Thiết bị chiếu xạ tia gamma nguồn Co-60 (Trung tâm chiếu xạ Hà Nội). - Máy đo liều ECB. Dosimeter D002 (Viện Năng lượng nguyên tử Việt Nam). - Máy quang phổ tử ngoại Shimadzu UV 2450 (Nhật Bản).
- Tủ sấy chân không Shel Lab (Mỹ). - Cân điện tử (độ chính xác 10-4
) EP320A Precisa (Thụy Sỹ). - Máy cất nước 2 lần (Anh quốc).
- Phổ hồng ngoại chuyển hóa Furrier (Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội). - Thiết bị hiển vi điện tử quét (Đại học Bách khoa Hà Nội).
- Các dụng cụ thủy tinh khác như bình tam giác đựng mẫu, cốc thủy tinh, phễu lọc, bình định mức, bình phản ứng, sinh hàn hồi lưu, bình làm khô.
2.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.1 Phƣơng pháp điều chế chitosan từ vỏ tôm
Chitosan được sản xuất từ vỏ tôm theo phương pháp chiết tách hóa học như trong trường hợp điều chế chitosan dùng trong y học [4]. Có thể lặp lại phản ứng deaxetyl hóa một vài lần để làm sạch chitosan thu được sau mỗi lần deaxetyl hóa nhằm thu được sản phẩm có độ DD cao như mong muốn. Quy trình điều chế được trình bày trên hình 9. Tuy nhiên, chitosan trong nghiên cứu này là sản phẩm deaxetyl hóa chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc, vì quá trình khử axetyl hóa lặp lại làm tăng chi phí sản xuất trong thực tế. Thực nghiệm tiến hành như sau:
Bước 1. Làm sạch vỏ tôm bằng cách loại bỏ chân, rác protein khác, rửa sạch và làm khô tự nhiên.
Bước 2. Loại tạp chất vô cơ (khử khoáng): cho 1 kg vỏ tôm vào bình thủy tinh dung tích 10 lít, thêm vào 5 lít dung dịch HCl 10% đến ngập, đảo đều, ngâm trong 12 giờ. Vớt ra và rửa bằng nước đến pH = 7, vỏ tôm thu được có mầu hồng nhạt và mềm do đã bị loại tạp chất vô cơ.
Bước 3. Loại protein (khử protein): vỏ tôm được cho vào bình phản ứng dung tích 500 ml, trang bị máy khuấy và sinh hàn hồi lưu, thêm vào 200 ml NaOH 3% đến ngập, đun ở 90 - 100C trong 2 giờ. Dung dịch có mầu nâu đỏ chứa protein bị
25
loại ra. Lặp lại quá trình trên một vài lần để loại bỏ hết tạp chất. Phần còn lại được vớt ra và rửa nhiều lần đến pH = 7, thu được chitin có mầu trắng phớt hồng.
Bước 4. Loại chất màu (khử màu): toàn bộ lượng chitin bán thành phẩm thu được chứa chất màu astaxanthin được ngâm trong 500 ml dung dịch KMnO4 1% trong các khoảng thời gian nhất định và rửa bằng acid oxalic 1% nhiều lần cho đến khi sản phẩm có mầu trắng hoàn toàn, rửa bằng nước đến pH = 7, sấy khô. Lượng chitin thu được có đặc tính gần giống như chitin sản xuất theo quy trình công nghiệp được dùng để điều chế chitosan.
Nhặt rác, thịt, chân, càng, rửa sạch
Dung dịch axit loãng Loại muối vô cơ Lặp lại vài lần
Loại protein Dung dịch NaOH loãng
(90-100C trong 2 giờ) Rửa sạch nhiều lần NaOH 40% (90-1000C trong 2 giờ) Deaxetyl hóa (lặp lại nhiều lần) Rửa, sấy Vỏ tôm Vỏ tôm sạch
Vỏ tôm đã loại tạp chất vô cơ
Vỏ tôm đã loại các tạp chất
Chitin
Chitosan tinh chế
Chitosan dạng vẩy
26
Bước 5. Deaxetyl hóa chitin thành chitosan: Các mầu chitin có trọng lượng khoảng 50 gam được đưa vào bình phản ứng dung tích 500 ml có trang bị khuấy từ, bổ sung khoảng 200 ml NaOH 50% cho đến ngập. Gia nhiệt đến 100C, khuấy mạnh trong 2 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, lọc bỏ dung dịch NaOH và rửa sạch sản phẩm bằng nước cất cho đến pH = 7, sấy khô ở 40C trong tủ sấy chân không thu được chitosan. Sản phẩm được đóng vào túi PE và bảo quản trong bình hút ẩm cho đến khi sử dụng.
2.2. Các phƣơng pháp xác định đặc tính của chitosan
Hai đặc tính quan trọng nhất quyết định khả năng ứng dụng của chitosan là trọng lượng phân tử và độ deacetyl hóa (DD) của nó đã được xác định bằng phương pháp độ nhớt và phổ hồng ngoại chuyển hóa Furrier.
2.2.1 Xác định khối lượng phân tử trung bình của chitosan
Khác với các hợp chất thấp phân tử có khối lượng phân tử là một hằng số, đặc trưng cho tính chất của một hợp chất nhất định, các hợp chất cao phân tử (polymer) được cấu tạo từ các đơn vị monomer liên kết với nhau thành mạch phân tử có độ dài thay đổi trong một khoảng nhất định. Vì vậy, không thể có được polymer
có trọng lượng chính xác, người ta đưa ra khái niệm khối lượng phân tử trung bình
̅) là giá trị trung bình thống kê của các mạch phân tử có trong sản phẩm polymer. Bên cạnh đó, phân bố trọng lượng phân tử cũng được xác định để đánh giá mức độ phân tán của các mạch phân tử có độ dài khác nhau. Để xác định trọng lượng phân tử trung bình của sản phẩm chitosan đạt được, trong nghiên cứu này phương pháp độ nhớt đã được sử dụng. Trong đó, chitosan được hòa tan vào hệ dung môi gồm axit axetic (CH3COOH) 0,5 M và sodium axetat (CH3COONa) 0,2 M thành các dung dịch có nồng độ (c) từ 0.01 đến 0.1%. Độ nhớt tương đối của dung dịch chitosan được tính bằng tỷ số giữa thời gian chảy của dung dịch chitosan (t) và dung
27
môi (t0) trong ống mao quản của nhớt kế ở 25C như trình bày trên hình 10. Các giá trị khác gồm độ nhớt đặc trưng, độ nhớt giới hạn, độ nhớt cố hữu của dung dịch chitosan được xác định theo công thức:
Độ nhớt tương đối: r /0 t/t0 (2.1)
Độ nhớt đặc trưng: sp r 1 (2.2)
Độ nhớt giới hạn: red sp/c (2.3)
Độ nhớt cố hữu: inhlnr/c (2.4)
Độ nhớt thực [] của chitosan được ngoại suy từ đồ thị phụ thuộc của độ nhớt giới hạn theo nồng độ dung dịch chitosan đến nồng độ c = 0 theo phương trình Huggins như sau:
sp/c = [] + k’[]2
c (2.5)
Trọng lượng phân tử trung bình của chitosan được tính từ độ nhớt thực theo phương trình Mark – Houwink –Sarada [31]:
[ ] = k. ̅ (2.6)
Trong đó:
̅ : khối lượng phân tử trung bình nhớt tính được [ ] : độ nhớt thực của sản phẩm chitosan (ml/g)
k, : là các thông số thực nghiệm tùy thuộc vào polyme và hệ dung môi sử dụng. Trong nghiên cứu này k = 3.5 × 104 và = 0,76.
2.2.2 Xác định độ deacetyl của chitosan thu được
Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử dụng để xác định mức DD của chitosan, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tính toán dựa trên các đỉnh phổ đặc trưng cho nhóm chức khác nhau của chitosan trên phổ hồng ngoại chuyển hóa Furrier (FT-IR) của nó.
28
Khoảng 5 mg mẫu chitosan được nghiền nhỏ cùng với 100 mg KBr thành dạng bột mịn, ép thành dạng đĩa mỏng trên thiết bị tạo mẫu. Mẫu chitosan được đặt trên giá để mẫu và đưa vào hệ đo phổ hồng ngoại thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên như trên hình. Phổ được ghi theo số sóng từ 600 - 4000 cm-1
, trong khoảng 30 giây. Phổ môi trường cũng được ghi lại trước mỗi lần đo để hiệu chỉnh đường nền.
Từ hình ảnh phổ IR của chitosan, diện tích phổ (Absorbance A), đặc trưng cho nhóm chức hydroxyl (OH) và acetyl (CH3C=O) của chitosan tại số sóng khoảng 3450 và 1650 cm-1 được xác định bằng diện tích đồ thị giới hạn bởi tiếp tuyến dựng được từ hai số sóng liền trước và liền sau chúng. Độ acetyl và deaxetyl hóa được tính theo công thức:
DA (%) = (A1655/A3450) 115 (2.7)
DD (%) = 100% - DA (%) (2.8)
2.3 Tạo hạt chitosan khâu mạch ion (chitosan bead)
Chitosan được hòa tan qua đêm trong 500 ml acid acetic 5% ở nhiệt độ phòng, lọc loại bỏ phần không tan, tạo thành các dung dịch có nồng độ thay đổi từ 1,5 đến 3%. Để tạo hạt chitosan khâu mạch bức xạ, TAIC được thêm vào với tỷ lệ từ 0,5 đến 5 wt% tính theo hàm lượng chitosan. Chitosan sau lọc được khấy đều và 50 ml dung dịch chitosan được đưa vào ống tiêm có kích thước xác định, nhỏ giọt vào cốc thủy tinh chứa 200 ml dung dịch sTPP 2% ở pH 9, trên máy khuấy từ với tốc độ khuấy khoảng 100 vòng phút để tăng khả năng tiếp xúc của giọt chất lỏng chitosan với sTPP. Khi chitosan tiếp xúc với sTPP, quá trình khâu mạch ion giữa các nhóm mang điện tích sẽ diễn ra, để hình thành các hạt chitosan (chitosan bead). Kích thước hạt được điều chỉnh theo độ lớn của ống nhỏ giọt. Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng một loại ống nhỏ giọt có kích thước xác định. Kích thước hạt khác nhau là do công thức tạo hạt khác nhau.
Sau 4 giờ khâu mạch, hạt chitosan được lọc ra và rửa bằng nước cất 2 lần đến pH trung tính, làm khô tự nhiên qua đêm trong không khí, và tiếp tục làm khô ở 40C trong tủ sấy chân không 24 giờ, thu được các hạt cườm, cứng có màu trắng trong đến hơi vàng. Hình dạng và kích thước hạt tạo thành được quan sát và xác định đối với các công thức thực nghiệm khác nhau.
29
2.4 Tạo hạt chitosan khâu mạch bền bằng xử lý chiếu xạ
2.4.1 Phương pháp xử lý chiếu xạ
Các hạt chitosan khâu mạch ion chứa chất khâu mạch TAIC được chia vào các túi PE, mỗi túi khoảng 5g. Các túi mẫu được gắn kèm liều kế, được đặt trong buồng chiếu xạ tại vị trí có suất liều 4,3 kGy/một giờ, thuộc Trung tâm chiếu xạ Hà Nội. Các vị trí khác nhau sẽ nhận được suất liều chiếu khác nhau, phụ thuộc vào tọa độ X, Y, Z tính từ tâm bảng nguồn như trên hình 10. Các mẫu
chitosan khác nhau được chiếu xạ trong những khoảng thời gian khác nhau sao cho đạt được liều chiếu lý thuyết là 20, 40, 60kGy. Sau quá trình chiếu xạ, các liều kế được tách riêng, bảo quản trong tối và giá trị liều hấp phụ được ghi lại bằng máy đo liều Dosimeter D002 với sai số ± 6%.
2.4.2 Xác định đặc trưng của hạt khâu mạch
Mức độ tạo gel và đặc tính của gel khâu mạch được đánh giá thông qua tỷ lệ gel khâu mạch thu được sau khi chiết trong dung môi và mức độ trương dung môi của gel thu được 13,14]. Trong nghiên cứu này, phần gel khô (gel fraction) của hạt khâu mạch được xác định bằng cách ngâm 1 gam hạt chitosan chiếu xạ trong 100 ml nước khử ion, khuấy mạnh ở 40C. Sau 72 giờ, phần gel không tan được vớt ra, sấy khô đến trọng lượng không đổi trong tủ sấy chân không. Phần trăm tạo gel (%) được tính theo công thức:
g (%) = [(Wi – Wd)]/Wi × 100 (2.9)
Ở đây: Wi, Wd là trọng lượng khô của hạt chitosan ban đầu và sau khi chiết loại bỏ phần chất tan trong nước.
Hình 10. Bố trí bảng nguồn trong buồng chiếu X
Y Z
30
Các hạt chitosan khâu mạch sau khi chiết được ngâm trong nước 48 giờ để xác định mức độ trương nước (Swelling degree, S) theo công thức:
S = (Ws - Wd)/Wd (2.10)
Ở đây Wd và Ws là trọng lượng mẫu gel khô và trọng lượng gel sau khi trương một lượng nước bão hòa.
2.5 Đánh giá khả năng hấp phụ của hạt chitosan khâu mạch
2.5.1 Chuẩn bị nước thải mẫu chứa thuốc nhuộm hoạt tính
Phụ thuộc vào yêu cầu về màu sắc đậm nhạt của sợi vải, các lượng thuốc nhuộm khác nhau sẽ được áp dụng để nhuộm màu. Trong trường hợp TNHT, lượng thuốc nhuộm trung bình cần dùng vào khoảng 1% so với khối lượng hàng nhuộm. Hiện nay, để nhuộm màu cho 1 kg sản phẩm, các cơ sở dệt nhuộm của Việt Nam thải ra khoảng 10 lít nước thải. Như đã trình bày trong phần tổng quan, một lượng lớn thuốc nhuộm thủy phân không liên kết được vào xơ sợi sẽ trôi theo nước thải sau quá trình hoàn tất, giặt. Theo các nghiên cứu của Đặng Xuân Việt, với mức độ gắn màu thực tế của TNHT khoảng 80%, 20% thuốc nhuộm còn lại, chủ yếu là thuốc nhuộm thủy phân đã thải ra môi trường [2]. Nghĩa là trong thực tế sẽ có khoảng 1% × 0,1 × 20% = 0,0002 kg TNHT trong 1 lít nước thải.
Vì vậy, để đánh giá khả năng hấp phụ thuốc nhuộm của vật liệu hấp phụ, cần phải chuẩn bị dung dịch nước thải mẫu chứa thành phần thuốc nhuộm thủy phân với hàm lượng tương ứng. Quá trình này được thực hiện như sau:
0,2 g Drimaren Red CL-5B được hoà tan trong 1 lít nước cất thành dung dịch 0,2 g/L, thêm vào vài giọt NaOH 0.1M để đạt được dung dịch màu có pH 11,5. Dung dịch được cho vào bình phản ứng có gắn sinh hàn hồi lưu và thuốc nhuộm được thủy phân hoàn toàn ở 100C trong 2 giờ. Dung dịch TNHT đã thuỷ phân được làm nguội đến nhiệt độ phòng được dùng như nước thải mẫu.
2.5.2 Khả năng hấp phụ của hạt chitosan khâu mạch đối với Drimaren Red
Cường độ hấp phụ của dung dịch màu được xác định theo phương pháp phổ tử ngoại – khả kiến, dựa trên định luật Lambert-Beer với phương trình hấp phụ:
31
Trong đó, A (absorbance) là cường độ hấp phụ ánh sáng; I0, I: cường độ bức xạ điện từ trước và sau khi qua chất phân tích (cường độ ánh sáng tới và ánh sáng truyền qua); là hệ số hấp phụ; l là chiều dày cuvet (lớp dung dịch cần đo) thường là 1 cm; C là nồng độ chất phân tích.
Để xác định mức độ hấp phụ của hạt chitosan khâu mạch, các lượng chất hấp phụ khác nhau được bổ sung vào cốc thủy tinh chứa 500 ml nước thải mẫu. Hệ được đặt vào tủ ấm có lắc và lắc ở các nhiệt độ khác nhau 25, 30, 35C. Sau những khoảng thời gian xác đinh, mẫu được lắng xuống và dung dịch chứa thuốc nhuộm được lấy ra, điều chỉnh đến pH 6 để xác định hàm lượng thuốc nhuộm.
Trong nghiên cứu này, hàm lượng Drimaren Red được xác định bằng phương pháp quang phổ kế sử dụng thiết bị phổ UV 2450 tại trung tâm Chiếu xạ Hà Nội. Bước sóng đo cường độ hấp phụ (Absorbance) được xác đinh cho Drimaren Red CL5B là khoảng 543 nm. Nồng độ TNHT được tính theo đường chuẩn về sự phụ thuộc cường độ hấp phụ vào nồng độ dung dịch thuốc nhuộm tạo được từ dung dịch gốc. Lượng TNHT bị hấp phụ được tính theo phương trình:
Qs = (Co – Cs)/m (2.12)
Trong đó, Qs là lượng thuốc nhuộm hấp phụ tính bằng mg/g; Co và Cs là nồng độ thuốc nhuộm ban đầu và sau hấp phụ, tính bằng mg/l, và m là trọng lượng chất hấp phụ, tính bằng g/l.
2.5.3 Khảo sát khả năng giải hấp phụ
Hiệu quả giải hấp phụ đối với TNHT Drimaren Red từ các hạt chitosan khâu mạch được đánh giá sau quá trình hấp phụ trước đó. Trong giai đoạn giải hấp phụ, các hạt chitosan chứa chất hấp phụ được cho vào bình phản ứng chứa nước loại ion, dung dịch được điều chỉnh đến pH 11 bằng NaOH 0.05M, khuấy mạnh trong 2 giờ. Sau đó hạt chitosan được tách ra và hàm lượng thuốc nhuộm còn dư được xác định. Để xác định lượng thuốc nhuộm giải hấp, dung dịch được điều chỉnh đến pH 6 và cường độ hấp phụ được đo trên thiết bị quang phổ tử ngoại - khả kiến. Hàm lượng chất nhuộm giải hấp được tính theo công thức:
32
Trong đó, Qd là lượng thuốc nhuộm giải hấp tính bằng mg/g; Cs và Cd là hàm lượng thuốc nhuộm trước và sau khi giải hấp tính bằng mg/l, và m là khối lượng chất hấp phụ.
Đối với hạt chitosan khâu mạch trong nghiên cứu này, các kết quả hấp phụ và