Nguyên tắc: Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả.
Trình tự gen 16S rARN của các chủng vi sinh vật được đọc trực tiếp trên máy phân trình tự tự động 3100-Avant Genetic Analyzer (Mỹ) tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
So sánh trình tự thu được với trình tự gen 16S rARN trong ngân hàng gen quốc tế (Gene Bank).
Xây dựng trên cây phân loại dựa trên phần mềm Treeview.
2.3.5. Phƣơng phá p xác định hoạt độ một số enzyme ngoại bào
2.3.5.1. Xác định khả năng sinh amylase
Nguyên tắc: Amylase là enzyme có khả năng thủy phân tinh bô ̣t cho sản phẩm cuối cùng glucose bằng viê ̣c cắt đứt liên kết nô ̣i chuỗi trong ph ân tử tinh bô ̣t . Khi nhuô ̣m Lugol, những vùng xung quanh lỗ tha ̣ch có enzyme phân giải tinh bô ̣t không b ị nhuô ̣m màu, những vùng không bi ̣ thủy phân bởi amylase sẽ chuyển sang màu xanh .
Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bị đĩa tha ̣ch chứa môi trường khoáng có bổ sung 1% tinh bô ̣t làm nguồn cacbon duy nhất.
Đu ̣c lỗ tha ̣ch : 1 điểm ở giữa và 4 điểm xung quanh.
làm nguồn cacbon.
Sau mô ̣t ngày nuôi cấy , ly tâm dung di ̣ch nuôi cấy 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu di ̣ch nổi.
Bổ sung vào lỗ thạch ở giữa 150µl nước làm đối chứng. Bổ sung vào 4 lỗ tha ̣ch xung quanh 150µl di ̣ch nuôi cấy. Để trong tủ ấm .
Sau mô ̣t ngày đem nhuô ̣m bằng dung di ̣ch Lugol và quan sát kết quả.
2.3.5.2. Xác định khả năng sinh cellulase
Nguyên tắc : cellulase thủy phân cellulose t hành glucose . Khi nhuô ̣m Lugol , những vùng xung quanh lỗ tha ̣ch có enzyme phân giải CMC không bi ̣ nhuô ̣m màu , những vùng không bi ̣ thủy phân bởi cellulase sẽ chuyển sang màu xanh tím .
Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bi ̣ đĩa tha ̣ch chứa môi trường khoáng có bổ sung 1% CMC làm nguồn cacbon.
Đu ̣c lỗ tha ̣ch : 1 điểm ở giữa và 4 điểm xung quanh.
Nuôi cấy lắc chủng vi sinh vâ ̣t trong môi trường khoáng có bổ sung 1% CMC làm nguồn cacbon.
Sau mô ̣t ngày nuôi cấy , ly tâm dung di ̣ch nuôi cấy 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu di ̣ch nổi.
Bổ sung vào lỗ tha ̣ch ở giữa 150µl nước làm đối chứng. Bổ sung vào 4 lỗ tha ̣ch xung quanh 150µl di ̣ch nuôi cấy. Để trong tủ ấm 370C.
Sau hai ngày đem nhuộm bằng dung di ̣ch Lugol và quan sát kết quả.
Để định lượng catalase người ta dùng dung dịch KMnO4 để xác định lượng H2O2 trước và sau khi enzyme tác dụng, từ đó tính được lượng H2O2 đã bị enzyme phân giải [16].
5H2O2 + 2KMnO4 + 3 H2SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O Sử dụng bình nón dung tích 250ml:
Bình 1: cho vào 5ml dung dịch enzyme và 10ml H2O2 0,2%. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Thêm 5ml H2SO4 10%. Chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện mầu hồng bền.
Bình 2: cho vào 5ml dung dịch enzyme, đun sôi cách thủy trong 5 phút. Sau đó tiến hành các bước tiếp theo tương tự bình mô ̣t.
Tính kết quả: Số mg H2O2 bị phân giải bởi 1ml dịch chiết enzyme được tính
theo công thức sau: X = (A - B) x(1,7)
V Trong đó:
A: thể tích KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ H2O2 trong bình kiểm tra. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B: thể tích KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ H2O2 còn lại trong bình thí nghiệm V: thể tích dung dịch enzym lấy để xác định
1,7: 1ml dung dịch KMnO4 0,1N tương ứng với 1,7mg H2O2
Số đơn vị catalase trong 1ml dịch chiết/μmol H2O2 bị phân giải sau 1 phút: Y = 30 x(X0,034) (đơn vị)
Trong đó: 30: thời gian enzym tác dụng theo đơn vị phút 0,034: 1µmol đương lượng H2O2 bằng 0,034mg.
2.3.5.4. Xác định hoạt độ protease
Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến. Theo phương pháp này một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn, sau 1 phút phân
giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong acid Trichloracetic (TCA) tương ứng với 1μmol tyrosine [16].
Cách tiến hành:
Bước 1: Lập đồ thị chuẩn tyrosine
Chuẩn bị các dung dịch tyrosine có nồng độ từ 0,01 đến 0,05 μmol bằng cách pha loãng dung dịch tyrosine chuẩn 1 μmol với dung dịch HCL 0,2N. Lập đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ protein như sau: cho 1ml dung dịch tyrosine đã pha loãng vào các ống nghiệm (số ống nghiệm bằng số dung dịch tyrosine đã pha loãng ), thêm 4ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 1ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng rồi đem so màu ở bước sóng 750nm. Sử dụng cuvette dày 1cm.
Bước 2: Chuẩn bị 2 ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm và ống kiểm tra.
Cho vào ống thí nghiệm 0,5ml dung dịch enzym giữ ở nhiệt độ 30ºC trong khoảng 10-15 phút. Thêm vào ống 1ml dung dịch casein 2% đạt 30ºC, lắc đều và giữ ống ở 30ºC trong 10 phút. Sau đó cho ngay vào 2,5ml acid trichloracetic 5%, lắc đều, giữ trong 30 phút ở 30ºC. Lọc lấy 0,5ml dung dịch lọc cho vào 1 ống nghiệm khác, thêm 2ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0,5ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, lắc đều, để 30 phút ở nhiệt phòng rồi đem so màu với bước sóng 750nm. Sử dụng cuvette dày 1cm.
Đối với ống kiểm tra: cho vào nghiệm 0,5ml enzyme, sau đó cho 2,5ml acid trichloracetic 5% vào ngay, lắc đều, rồi cho thêm 1ml dung dịch casein 2%. Tiến hành các bước tiếp theo tương tự như trên.
Bước 3: Tính kết quả
Lấy hiệu số của giá trị độ hấp thụ quang giữa mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, đối chiếu với đồ thị chuẩn, tính ra nồng độ tyrosine tương ứng.
t a
X 4
Trong đó: X: là số đơn vị hoạt động trong 1ml dung dịch enzyme
a: số µmol tyrosine tương ứ ng với hiê ̣u số giá tri ̣ mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c của ống thí nghiê ̣m và ống kiểm tra.
4: là thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng t: là thời gian phản ứng (10 phút)
2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá khả năng phân hủy PLA 2.3.6.1. Phƣơng pháp đo vòng phân hủy PLA 2.3.6.1. Phƣơng pháp đo vòng phân hủy PLA
Nguyên tắc: Vi sinh vật có khả năng phân hủy PLA sẽ tạo vòng phân hủy trên đĩa thạch có PLA làm nguồn cac bon duy nhất. Khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Iodonitrotetrazolium chloride (INT), những vùng nào có mặt vi sinh vật sẽ hiện lên rõ nét với màu đỏ. INT là một chất được sử dụng để phát hiện hoạt tính của enzyme dehydrogenase có mặt trong quá trình hô hấp hiếu khí và kị khí của vi sinh vật [40]. Điện tử và hydro được tách ra từ cơ chất bởi enzym này sẽ được chuyển đến một chất nhận hydro, thường là một Co-enzym để tạo thành chất kết tinh có màu đỏ [24].
Tiến hành:
Chuẩn bi ̣ đĩa tha ̣ch chứa môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon duy nhất.
Đu ̣c lỗ tha ̣ch : 1 điểm ở giữa và 4 điểm xung quanh.
Nuôi cấy lắc chủ ng vi sinh vâ ̣t trong m ôi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon.
Sau một tuần nuôi cấy, bổ sung vào 4 lỗ tha ̣ch xung quanh 150µl di ̣ch nuôi cấy của 4 chủng vi sinh vật.
Bổ sung vào lỗ tha ̣ch ở giữa 150µl nước làm đối chứng. Để trong tủ ấm .
Sau 5 ngày đem nhuộm bằng INT 0,25% và quan sát kết quả. Đo vòng phân hủy PLA của các chủng vi sinh vật.
2.3.6.2. Phƣơng pháp thu hồi PLA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên tắc: Để đánh giá khả năng phân hủy PLA của các chủng vi sinh vật, tiến hành nuôi các chủng trong môi trường khoáng có bổ sung PLA làm nguồn cac bon duy nhất. Đánh giá khả năng phân hủy PLA của chủng được nghiên cứu dựa vào lượng PLA thu hồi trong mẫu thí nghiệm và trọng lượng tế bào khô thu được [59].
Tiến hành :
Chuẩn bị môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA : cân lượng chính xác là 2g PLA cho 1 lít dung dịch khoáng có bổ sung thêm 20mg giống.
Nuôi cấy lắc ở điều kiện 370C và 170 vòng/phút.
Tiến hành thu hồi lượng PLA tại các thời điểm 10, 15, 20 ngày. Đồng thời cân trọng lượng tế bào khô thu được đến lượng không đổi.
Lượng PLA được thu hồi bằng cách ly tâm dịch nuôi cấy, thu phần cặn bao gồm PLA và tế bào.
Dùng Chloroform để hòa tan PLA trong cặn, dùng pipet tách lấy phần chất lỏng tan gồm chloroform và PLA, phần chất lỏng này để ở nhiệt độ thường chloroform sẽ bay hơi hết, đem sấy khô phần còn lại đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 70º trong 24 giờ, thu hồi được PLA.
Tế bào vi sinh vật sau khi tách PLA cũng được sấy khô đến lượng không đổi ở nhiệt độ 105º trong 6 giờ.
2.3.6.3. Phƣơng pháp tăng khả năng phân hủy PLA
Nguyên tắc: Khả năng phân huỷ PLA cũng như một số các polymer sinh học khác của các chủng vi sinh vật có thể tăng lên nếu bổ sung thêm các chất cảm ứng như
Bổ sung vào môi trường nuôi cấy 0,1% các chất cảm ứng: Casein, gelatin, pepton, cao nấm men.
Nuôi cấy lắc ở điều kiện 370C và 170 vòng/phút.
Sau 3 ngày, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng nghiên cứu dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600nm [25].
2.3.7. Phƣơng pháp tối ƣu hóa các điều kiện nhiê ̣t đô ̣, pH, nồng đô ̣ muối NaCl NaCl
Mỗi chủng vi sinh vâ ̣t đều phát triển tốt nhất ở những điều kiê ̣n thích hợp . Khi nhiệt đô ̣, pH, nồng đô ̣ muối NaCl không thích hợ p sẽ tác đô ̣ng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật . Tối ưu hóa các điều kiện của chủng nghiên cứu trong môi trường có sử dụng PLA làm nguồn cơ chất duy nhất, giúp cho quá trình phân hủy PLA diễn ra nhanh và thu được lượng tế bào lớn nhất.
Chủng vi sinh v ật đươ ̣c nuôi lắc trong môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon , nuôi chủng ở các nhi ệt độ: 200, 370, 500, 600, 650 và 700, nuôi chủng ở các pH trong kho ảng từ 4 đến 9, nuôi chủng trong môi trườ ng có nồng đô ̣ NaCl tương ứng là: 0%; 0,5%; 1%; 2%; 3%; 4% và 5%.
Sau 3 ngày nuôi cấy , tiến hành quan sát , đánh giá khả năng sinh trư ởng của chủng nghiên cứu dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600nm [25].
2.3.8. Phƣơng pháp thống kê sinh học
Các thí nghiệm (phân tích) được lặp lại ít nhất 3 lần. Các số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm Excel.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PLA
Sau khi thu mẫu, chúng tôi tiến hành cấy trải trên môi trường khoáng có bổ sung PLA. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 37oC, kết quả cho thấy số lươ ̣ng vi sinh vâ ̣t thu đươ ̣c còn thấp (hình 6a). Số lượng khuẩn lạc thu được không đa dạng và kích thước nhỏ.
Đồng thời với việc phân lập trực tiếp, chúng tôi tiến hành nuôi cấy lắc trong môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA (w/v). Đây là cách thức để làm giàu số lượng vi sinh vật trong mẫu. Sau một tuần nuôi lắc ở 37oC, chúng tôi tiến hành cấy trải trên môi trường khoáng có bổ sung PLA làm nguồn cacbon duy nhất . Sau 3 ngày nuôi cấy ở 37oC, chúng tôi kiểm tra số lượng khuẩn lạc và các dạng khuẩn lạc thu được ở từng mẫu (hình 6b).
Kết quả cho thấy số lượng khuẩn la ̣c tăng lên và kích thước của các khuẩn lạc lớn hơn. Các ch ủng vi sinh vật thu được khá đa dạng bao gồm các nhóm vi sinh vật như nấm, xạ khuẩn và phần lớn là vi khuẩn. Dựa trên kích thước phát triển cũng như đă ̣c điểm hình thái của các chủng vi sinh vâ ̣t, chúng tôi đã chọn ra 12 chủng được ký hiệu T1 đến T12 cho mục đích tuyển cho ̣n tiếp theo (bảng 1).
Bảng 1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng vi sinh vật
STT Ký hiệu
chủng
Hình thái khuẩn lạc
1 T1 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước to, khuẩn lạc hình bầu dục, bề
mặt nhẵn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2 T2 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước to, khuẩn lạc tròn, bề mặt bóng, nhẵn và ướt, ở giữa khuẩn lạc có nhân màu trắng.
3 T3 Khuẩn lạc màu trắng, kích thước trung bình, khuẩn lạc tròn, bề mặt bóng, có nhân hình bầu dục
4 T4 Khuẩn lạc màu trắng sáng, kích thước bé, khuẩn lạc hình cầu, bề
6 T6 Khuẩn lạc màu trắng, kích thước trung bình, khuẩn lạc hình bầu dục, nhân nhỏ.
7 T7 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước nhỏ, khuẩn lạc hơi dài, nhân
nhỏ.
8 T8 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước nhỏ, khuẩn lạc dài, có nhân
hình bầu dục.
9 T9 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước nhỏ, khuẩn lạc hình cầu, có
nhân hình tia.
10 T10 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước to, khuẩn lạc hình bầu dục, nhân tròn, nhỏ.
11 T11 Khuẩn lạc màu trắng, Kích thước trung bình, khuẩn lạc tròn, không có nhân.
12 T12 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước trung bình, khuẩn lạc tròn, nhân nhỏ, có viền xung quanh nhân.
(a) (b)
Hình 6. Một số chủng vi sinh vật phân lập và phát triển trên môi trường khoáng có bổ sung PLA.
(a) Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật phân lập sau 3 ngày thu mẫu
(b) Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật phân lập sau khi nuôi lắc 1 tuần.
Mười hai chủng vi sinh vật thu được, chúng tôi tiếp tục tiến hành nuôi lắc trong môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon duy nhất ở 37oC. Sau 7
ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 370C, số lượng tế bào phát triển trong các mẫu được thể hiện trên bảng 2.
Bảng 2: Khả năng phát triển một số chủng vi sinh vật trong môi trường khoáng có bổ sung PLA 0,2% (w/v) STT Chủng vi sinh vật Số lượng tế bào (CFU/ml) Khả năng phát triển 1 T1 10x108 +++ 2 T2 12x108 +++ 3 T3 74x107 ++ 4 T4 11x108 +++ 5 T5 71x107 ++ 6 T6 72x106 + 7 T7 45x106 + 8 T8 8x108 +++ 9 T9 68x107 ++ 10 T10 24x106 + 11 T11 19x106 + 12 T12 22x106 +
Chú thích: +: phát triển yếu, ++: phát triển trung bình, +++: phát triển mạnh
Dựa vào số lượng khuẩn lạc phát triển trong môi trường nuôi cấy, chúng tôi chia các chủng vi sinh vật phân lập được thành các nhóm khác nhau: nhóm phát triển mạnh có số lượng khuẩn lạc trên 108 CFU/ml bao gồm có 4 chủng T1, T2, T4, T8, nhóm phát triển trung bình có số lượng khuẩn lạc từ 107 đến dưới 108 CFU/ml có 3 chủng là T3, T5, T9 và nhóm phát triển yếu có số lượng khuẩn lạc dưới 107
CFU/ml gồm có 5 chủng là T6, T7, T10, T11, T12 (bảng 2).
4 chủng có khả năng phân hủy PLA mạnh nhất là các chủng có ký hiệu T1, T2, T4, T8. Từ 4 chủng này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sàng lọc chủng có khả năng phân hủy PLA tốt nhất dựa vào phương pháp đo vòng phân hủy PLA.
Sau 5 ngày nuôi cấy, trên môi trường thạch khoáng bổ sung PLA cả 4 chủng đều có khả năng tạo vòng phân hủy khá rõ. Trong đó chủng T2 có khả năng tạo vòng