Sau khi thu mẫu, chúng tôi tiến hành cấy trải trên môi trường khoáng có bổ sung PLA. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 37oC, kết quả cho thấy số lươ ̣ng vi sinh vâ ̣t thu đươ ̣c còn thấp (hình 6a). Số lượng khuẩn lạc thu được không đa dạng và kích thước nhỏ.
Đồng thời với việc phân lập trực tiếp, chúng tôi tiến hành nuôi cấy lắc trong môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA (w/v). Đây là cách thức để làm giàu số lượng vi sinh vật trong mẫu. Sau một tuần nuôi lắc ở 37oC, chúng tôi tiến hành cấy trải trên môi trường khoáng có bổ sung PLA làm nguồn cacbon duy nhất . Sau 3 ngày nuôi cấy ở 37oC, chúng tôi kiểm tra số lượng khuẩn lạc và các dạng khuẩn lạc thu được ở từng mẫu (hình 6b).
Kết quả cho thấy số lượng khuẩn la ̣c tăng lên và kích thước của các khuẩn lạc lớn hơn. Các ch ủng vi sinh vật thu được khá đa dạng bao gồm các nhóm vi sinh vật như nấm, xạ khuẩn và phần lớn là vi khuẩn. Dựa trên kích thước phát triển cũng như đă ̣c điểm hình thái của các chủng vi sinh vâ ̣t, chúng tôi đã chọn ra 12 chủng được ký hiệu T1 đến T12 cho mục đích tuyển cho ̣n tiếp theo (bảng 1).
Bảng 1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng vi sinh vật
STT Ký hiệu
chủng
Hình thái khuẩn lạc
1 T1 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước to, khuẩn lạc hình bầu dục, bề
mặt nhẵn.
2 T2 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước to, khuẩn lạc tròn, bề mặt bóng, nhẵn và ướt, ở giữa khuẩn lạc có nhân màu trắng.
3 T3 Khuẩn lạc màu trắng, kích thước trung bình, khuẩn lạc tròn, bề mặt bóng, có nhân hình bầu dục
4 T4 Khuẩn lạc màu trắng sáng, kích thước bé, khuẩn lạc hình cầu, bề
6 T6 Khuẩn lạc màu trắng, kích thước trung bình, khuẩn lạc hình bầu dục, nhân nhỏ.
7 T7 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước nhỏ, khuẩn lạc hơi dài, nhân
nhỏ.
8 T8 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước nhỏ, khuẩn lạc dài, có nhân
hình bầu dục.
9 T9 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước nhỏ, khuẩn lạc hình cầu, có
nhân hình tia.
10 T10 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước to, khuẩn lạc hình bầu dục, nhân tròn, nhỏ.
11 T11 Khuẩn lạc màu trắng, Kích thước trung bình, khuẩn lạc tròn, không có nhân.
12 T12 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước trung bình, khuẩn lạc tròn, nhân nhỏ, có viền xung quanh nhân.
(a) (b)
Hình 6. Một số chủng vi sinh vật phân lập và phát triển trên môi trường khoáng có bổ sung PLA.
(a) Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật phân lập sau 3 ngày thu mẫu
(b) Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật phân lập sau khi nuôi lắc 1 tuần.
Mười hai chủng vi sinh vật thu được, chúng tôi tiếp tục tiến hành nuôi lắc trong môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon duy nhất ở 37oC. Sau 7
ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 370C, số lượng tế bào phát triển trong các mẫu được thể hiện trên bảng 2.
Bảng 2: Khả năng phát triển một số chủng vi sinh vật trong môi trường khoáng có bổ sung PLA 0,2% (w/v) STT Chủng vi sinh vật Số lượng tế bào (CFU/ml) Khả năng phát triển 1 T1 10x108 +++ 2 T2 12x108 +++ 3 T3 74x107 ++ 4 T4 11x108 +++ 5 T5 71x107 ++ 6 T6 72x106 + 7 T7 45x106 + 8 T8 8x108 +++ 9 T9 68x107 ++ 10 T10 24x106 + 11 T11 19x106 + 12 T12 22x106 +
Chú thích: +: phát triển yếu, ++: phát triển trung bình, +++: phát triển mạnh
Dựa vào số lượng khuẩn lạc phát triển trong môi trường nuôi cấy, chúng tôi chia các chủng vi sinh vật phân lập được thành các nhóm khác nhau: nhóm phát triển mạnh có số lượng khuẩn lạc trên 108 CFU/ml bao gồm có 4 chủng T1, T2, T4, T8, nhóm phát triển trung bình có số lượng khuẩn lạc từ 107 đến dưới 108 CFU/ml có 3 chủng là T3, T5, T9 và nhóm phát triển yếu có số lượng khuẩn lạc dưới 107
CFU/ml gồm có 5 chủng là T6, T7, T10, T11, T12 (bảng 2).
4 chủng có khả năng phân hủy PLA mạnh nhất là các chủng có ký hiệu T1, T2, T4, T8. Từ 4 chủng này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sàng lọc chủng có khả năng phân hủy PLA tốt nhất dựa vào phương pháp đo vòng phân hủy PLA.
Sau 5 ngày nuôi cấy, trên môi trường thạch khoáng bổ sung PLA cả 4 chủng đều có khả năng tạo vòng phân hủy khá rõ. Trong đó chủng T2 có khả năng tạo vòng phân hủy lớn nhất, đường kính vòng phân hủy gần 2,5 cm, các chủng còn lại có vòng phân giải thấp hơn dưới 1,2 cm (hình 7).
Hình 7. Khả năng phân hủy PLA của các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường thạch bổ sung PLA (sử dụng thuốc nhuộm INT)
Khả năng phân huỷ PLA được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng hầu hết đều thuộc lớp xạ khuẩn [57]. Theo Jarerat và cộng sự thì các xạ khuẩn có khả năng phân hủy PLA chủ yếu là các loài thuộc họ Pseudonocardiaceae và các chi liên
Streptoalloteichus. Trong đó chi Saccharothrix có khả năng phân hủy PLA mạnh nhất [41]. Theo Nguyễn Quang Huy và cộng sự trong số 6 chủng xạ khuẩn được phân lập có khả năng phân hủy PLA, chủng XKG3 và XKG5 có khả năng phân hủy PLA mạnh nhất. Sau 20 ngày nuôi cấy lắc, chủng XKG3 và XKG5 có khả năng phân hủy PLA- Sn45 tương ứng là 43,09% và 41,04%; phân hủy PLA-Sn75 tương ứng là 43,87% và 51,75% [13].
Torres và cộng sự đã phân lập được trên 14 loài nấm khác nhau trong tự nhiên sử sụng PLA [52]. Nguyễn Quang Huy và cộng sự đã phân lập được chủng Penicillium
citrinum Thom có khả năng phân hủy PLA [12]. Không có nhiều công bố về khả năng
phân hủy PLA từ các chủng vi khuẩn. Chủng vi khuẩn T2 là một trong số ít chủng được biết có khả năng phân hủy PLA, do đó chúng tôi lựa chọn chủng vi khuẩn T2 này cho các nghiên cứu tiếp theo.