2.3.6.1. Phƣơng pháp đo vòng phân hủy PLA
Nguyên tắc: Vi sinh vật có khả năng phân hủy PLA sẽ tạo vòng phân hủy trên đĩa thạch có PLA làm nguồn cac bon duy nhất. Khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Iodonitrotetrazolium chloride (INT), những vùng nào có mặt vi sinh vật sẽ hiện lên rõ nét với màu đỏ. INT là một chất được sử dụng để phát hiện hoạt tính của enzyme dehydrogenase có mặt trong quá trình hô hấp hiếu khí và kị khí của vi sinh vật [40]. Điện tử và hydro được tách ra từ cơ chất bởi enzym này sẽ được chuyển đến một chất nhận hydro, thường là một Co-enzym để tạo thành chất kết tinh có màu đỏ [24].
Tiến hành:
Chuẩn bi ̣ đĩa tha ̣ch chứa môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon duy nhất.
Đu ̣c lỗ tha ̣ch : 1 điểm ở giữa và 4 điểm xung quanh.
Nuôi cấy lắc chủ ng vi sinh vâ ̣t trong m ôi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon.
Sau một tuần nuôi cấy, bổ sung vào 4 lỗ tha ̣ch xung quanh 150µl di ̣ch nuôi cấy của 4 chủng vi sinh vật.
Bổ sung vào lỗ tha ̣ch ở giữa 150µl nước làm đối chứng. Để trong tủ ấm .
Sau 5 ngày đem nhuộm bằng INT 0,25% và quan sát kết quả. Đo vòng phân hủy PLA của các chủng vi sinh vật.
2.3.6.2. Phƣơng pháp thu hồi PLA
Nguyên tắc: Để đánh giá khả năng phân hủy PLA của các chủng vi sinh vật, tiến hành nuôi các chủng trong môi trường khoáng có bổ sung PLA làm nguồn cac bon duy nhất. Đánh giá khả năng phân hủy PLA của chủng được nghiên cứu dựa vào lượng PLA thu hồi trong mẫu thí nghiệm và trọng lượng tế bào khô thu được [59].
Tiến hành :
Chuẩn bị môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA : cân lượng chính xác là 2g PLA cho 1 lít dung dịch khoáng có bổ sung thêm 20mg giống.
Nuôi cấy lắc ở điều kiện 370C và 170 vòng/phút.
Tiến hành thu hồi lượng PLA tại các thời điểm 10, 15, 20 ngày. Đồng thời cân trọng lượng tế bào khô thu được đến lượng không đổi.
Lượng PLA được thu hồi bằng cách ly tâm dịch nuôi cấy, thu phần cặn bao gồm PLA và tế bào.
Dùng Chloroform để hòa tan PLA trong cặn, dùng pipet tách lấy phần chất lỏng tan gồm chloroform và PLA, phần chất lỏng này để ở nhiệt độ thường chloroform sẽ bay hơi hết, đem sấy khô phần còn lại đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 70º trong 24 giờ, thu hồi được PLA.
Tế bào vi sinh vật sau khi tách PLA cũng được sấy khô đến lượng không đổi ở nhiệt độ 105º trong 6 giờ.
2.3.6.3. Phƣơng pháp tăng khả năng phân hủy PLA
Nguyên tắc: Khả năng phân huỷ PLA cũng như một số các polymer sinh học khác của các chủng vi sinh vật có thể tăng lên nếu bổ sung thêm các chất cảm ứng như
Bổ sung vào môi trường nuôi cấy 0,1% các chất cảm ứng: Casein, gelatin, pepton, cao nấm men.
Nuôi cấy lắc ở điều kiện 370C và 170 vòng/phút.
Sau 3 ngày, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng nghiên cứu dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600nm [25].
2.3.7. Phƣơng pháp tối ƣu hóa các điều kiện nhiê ̣t đô ̣, pH, nồng đô ̣ muối NaCl NaCl
Mỗi chủng vi sinh vâ ̣t đều phát triển tốt nhất ở những điều kiê ̣n thích hợp . Khi nhiệt đô ̣, pH, nồng đô ̣ muối NaCl không thích hợ p sẽ tác đô ̣ng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật . Tối ưu hóa các điều kiện của chủng nghiên cứu trong môi trường có sử dụng PLA làm nguồn cơ chất duy nhất, giúp cho quá trình phân hủy PLA diễn ra nhanh và thu được lượng tế bào lớn nhất.
Chủng vi sinh v ật đươ ̣c nuôi lắc trong môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon , nuôi chủng ở các nhi ệt độ: 200, 370, 500, 600, 650 và 700, nuôi chủng ở các pH trong kho ảng từ 4 đến 9, nuôi chủng trong môi trườ ng có nồng đô ̣ NaCl tương ứng là: 0%; 0,5%; 1%; 2%; 3%; 4% và 5%.
Sau 3 ngày nuôi cấy , tiến hành quan sát , đánh giá khả năng sinh trư ởng của chủng nghiên cứu dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600nm [25].
2.3.8. Phƣơng pháp thống kê sinh học
Các thí nghiệm (phân tích) được lặp lại ít nhất 3 lần. Các số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm Excel.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PLA
Sau khi thu mẫu, chúng tôi tiến hành cấy trải trên môi trường khoáng có bổ sung PLA. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 37oC, kết quả cho thấy số lươ ̣ng vi sinh vâ ̣t thu đươ ̣c còn thấp (hình 6a). Số lượng khuẩn lạc thu được không đa dạng và kích thước nhỏ.
Đồng thời với việc phân lập trực tiếp, chúng tôi tiến hành nuôi cấy lắc trong môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA (w/v). Đây là cách thức để làm giàu số lượng vi sinh vật trong mẫu. Sau một tuần nuôi lắc ở 37oC, chúng tôi tiến hành cấy trải trên môi trường khoáng có bổ sung PLA làm nguồn cacbon duy nhất . Sau 3 ngày nuôi cấy ở 37oC, chúng tôi kiểm tra số lượng khuẩn lạc và các dạng khuẩn lạc thu được ở từng mẫu (hình 6b).
Kết quả cho thấy số lượng khuẩn la ̣c tăng lên và kích thước của các khuẩn lạc lớn hơn. Các ch ủng vi sinh vật thu được khá đa dạng bao gồm các nhóm vi sinh vật như nấm, xạ khuẩn và phần lớn là vi khuẩn. Dựa trên kích thước phát triển cũng như đă ̣c điểm hình thái của các chủng vi sinh vâ ̣t, chúng tôi đã chọn ra 12 chủng được ký hiệu T1 đến T12 cho mục đích tuyển cho ̣n tiếp theo (bảng 1).
Bảng 1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng vi sinh vật
STT Ký hiệu
chủng
Hình thái khuẩn lạc
1 T1 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước to, khuẩn lạc hình bầu dục, bề
mặt nhẵn.
2 T2 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước to, khuẩn lạc tròn, bề mặt bóng, nhẵn và ướt, ở giữa khuẩn lạc có nhân màu trắng.
3 T3 Khuẩn lạc màu trắng, kích thước trung bình, khuẩn lạc tròn, bề mặt bóng, có nhân hình bầu dục
4 T4 Khuẩn lạc màu trắng sáng, kích thước bé, khuẩn lạc hình cầu, bề
6 T6 Khuẩn lạc màu trắng, kích thước trung bình, khuẩn lạc hình bầu dục, nhân nhỏ.
7 T7 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước nhỏ, khuẩn lạc hơi dài, nhân
nhỏ.
8 T8 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước nhỏ, khuẩn lạc dài, có nhân
hình bầu dục.
9 T9 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước nhỏ, khuẩn lạc hình cầu, có
nhân hình tia.
10 T10 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước to, khuẩn lạc hình bầu dục, nhân tròn, nhỏ.
11 T11 Khuẩn lạc màu trắng, Kích thước trung bình, khuẩn lạc tròn, không có nhân.
12 T12 Khuẩn lạc màu trắng đục, kích thước trung bình, khuẩn lạc tròn, nhân nhỏ, có viền xung quanh nhân.
(a) (b)
Hình 6. Một số chủng vi sinh vật phân lập và phát triển trên môi trường khoáng có bổ sung PLA.
(a) Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật phân lập sau 3 ngày thu mẫu
(b) Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật phân lập sau khi nuôi lắc 1 tuần.
Mười hai chủng vi sinh vật thu được, chúng tôi tiếp tục tiến hành nuôi lắc trong môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon duy nhất ở 37oC. Sau 7
ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 370C, số lượng tế bào phát triển trong các mẫu được thể hiện trên bảng 2.
Bảng 2: Khả năng phát triển một số chủng vi sinh vật trong môi trường khoáng có bổ sung PLA 0,2% (w/v) STT Chủng vi sinh vật Số lượng tế bào (CFU/ml) Khả năng phát triển 1 T1 10x108 +++ 2 T2 12x108 +++ 3 T3 74x107 ++ 4 T4 11x108 +++ 5 T5 71x107 ++ 6 T6 72x106 + 7 T7 45x106 + 8 T8 8x108 +++ 9 T9 68x107 ++ 10 T10 24x106 + 11 T11 19x106 + 12 T12 22x106 +
Chú thích: +: phát triển yếu, ++: phát triển trung bình, +++: phát triển mạnh
Dựa vào số lượng khuẩn lạc phát triển trong môi trường nuôi cấy, chúng tôi chia các chủng vi sinh vật phân lập được thành các nhóm khác nhau: nhóm phát triển mạnh có số lượng khuẩn lạc trên 108 CFU/ml bao gồm có 4 chủng T1, T2, T4, T8, nhóm phát triển trung bình có số lượng khuẩn lạc từ 107 đến dưới 108 CFU/ml có 3 chủng là T3, T5, T9 và nhóm phát triển yếu có số lượng khuẩn lạc dưới 107
CFU/ml gồm có 5 chủng là T6, T7, T10, T11, T12 (bảng 2).
4 chủng có khả năng phân hủy PLA mạnh nhất là các chủng có ký hiệu T1, T2, T4, T8. Từ 4 chủng này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sàng lọc chủng có khả năng phân hủy PLA tốt nhất dựa vào phương pháp đo vòng phân hủy PLA.
Sau 5 ngày nuôi cấy, trên môi trường thạch khoáng bổ sung PLA cả 4 chủng đều có khả năng tạo vòng phân hủy khá rõ. Trong đó chủng T2 có khả năng tạo vòng phân hủy lớn nhất, đường kính vòng phân hủy gần 2,5 cm, các chủng còn lại có vòng phân giải thấp hơn dưới 1,2 cm (hình 7).
Hình 7. Khả năng phân hủy PLA của các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường thạch bổ sung PLA (sử dụng thuốc nhuộm INT)
Khả năng phân huỷ PLA được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng hầu hết đều thuộc lớp xạ khuẩn [57]. Theo Jarerat và cộng sự thì các xạ khuẩn có khả năng phân hủy PLA chủ yếu là các loài thuộc họ Pseudonocardiaceae và các chi liên
Streptoalloteichus. Trong đó chi Saccharothrix có khả năng phân hủy PLA mạnh nhất [41]. Theo Nguyễn Quang Huy và cộng sự trong số 6 chủng xạ khuẩn được phân lập có khả năng phân hủy PLA, chủng XKG3 và XKG5 có khả năng phân hủy PLA mạnh nhất. Sau 20 ngày nuôi cấy lắc, chủng XKG3 và XKG5 có khả năng phân hủy PLA- Sn45 tương ứng là 43,09% và 41,04%; phân hủy PLA-Sn75 tương ứng là 43,87% và 51,75% [13].
Torres và cộng sự đã phân lập được trên 14 loài nấm khác nhau trong tự nhiên sử sụng PLA [52]. Nguyễn Quang Huy và cộng sự đã phân lập được chủng Penicillium
citrinum Thom có khả năng phân hủy PLA [12]. Không có nhiều công bố về khả năng
phân hủy PLA từ các chủng vi khuẩn. Chủng vi khuẩn T2 là một trong số ít chủng được biết có khả năng phân hủy PLA, do đó chúng tôi lựa chọn chủng vi khuẩn T2 này cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Đặc điểm hình thái của chủng T2
Để bước đầu nghiên cứu, phân loại chủng T2, chúng tôi tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc của T2 trên môi trường khoáng có bổ sung PLA.
Kết quả nhuộm Gram và quan sát dưới k ính hiển vi quang học ở vật kính với độ phóng đại 100 cho thấy chủng T2 có hình que ng ắn, các tế bào nằm riêng rẽ, bắt màu đỏ tía khi nhuô ̣m Gram . Điều này cho chúng tôi kết luâ ̣n : chủng T 2 thuô ̣c nhóm vi khuẩn Gram âm (hình 9).
Hình 9. Chủng T2 dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100
Quan sát dưới kính hiển vi điê ̣n tử quét JEOL –5410 LV, chúng tôi nhận thấy chủng vi khuẩn T 2 có dạng hình que ngắn (rod), khuẩn lạc bóng hơi nhầy. Bao quanh tế bào có lớp màng, màng này có chứa lipopolysaccharide (hình 10).
.
a) b)
Hình 10. Hình thái chủng T2 dưới kính hiển vi điê ̣n tử quét
Hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét ở độ phóng đại 5.000 lần (a) và 10.000 lần (b)
Từ những đặc điểm này cho thấy chủng T2 có khả năng thuộc vào nhóm Entero bacterium.
3.3. Phân loại chủng T2 dựa trên trình tự 16S rARN
Để xác định phân loại chủng T2 ở mức độ phân tử chúng tôi đã tiến hành giải trình tự gen 16S rARN. Kết quả giải trình tự gen được so sánh với trình tự gen 16S rARN trong ngân hàng gen quốc tế dựa trên phần mềm Treeview (hình 11).
Hình 11. Vị trí phân loại chủng T2và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào
trình tự gen 16S rARN
Kết quả giải trình tự gen 16S rARN của chủng T2 cho thấy đoạn trình tự này
tương đồng 99,9% (1398/1400 bp) với đoạn 16S rARN của Klebsiella
variicola_AJ783916; tương đồng 99,6% (1394/1400 bp) với Klebsiella
pneumoniae_X87276 (hình 11). Điều này cho phép chúng tôi kết luận: chủng vi khuẩn
T2 thuộc chi Klebsiella, và có tên khoa học là Klebsiella variicola.
Chi Klebsiella thường phân bố trong đất, nước và trong một số mẫu bệnh phẩm
Shimwellia pseudoproteus_ FJ267523 Enterobacter pulveris_DQ273684 Pantoea gaviniae_GQ367483 Pantoea calida_GQ367478 Erwinia amylovora_AJ233410 100
Salmonella subterranea_ AY373829
52
Klebsiella oxytoca_AF129440 Enterobacter dissolvens_Z96079
Enterobacter cloacae_AJ251469
Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae_AF130982
Klebsiella pneumoniae subsp. rhinoscleromatis_Y17657 Klebsiella singaporensis_ AF250285
T2 Klebsiella variicola_AJ783916 Klebsiella pneumoniae_X87276 84 69 61 83 100 81 53 59 92 55 0.01
bởi khả năng làm suy thoái thuốc diệt cỏ của chủng Klebsiella này [64]. Hầu hết các nghiên cứu phân lập vi sinh vật phân hủy PLA trên thế giới cho thấy chủ yếu là các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, Vibrio, Methylococcus…Ở Việt Nam, theo Nguyễn Quang Huy và cộng sự các chủng phân hủy PLA cũng thuộc chi Bacillus. Hiện nay, chưa có nhiều công bố về khả năng phân hủy PLA hay polymer sinh học của các loài thuộc chi này. Tại Việt Nam đây là những công bố đầu tiên về hoạt tính phân hủy PLA từ chi Klebsiella.
3.4. Hoạt độ một số enzym ngoại bào của chủng T2
Khả năng phân hủy PLA theo tác giả Tokiwa [17], Nguyễn Quang Huy và tập thể [13] có liên quan đến khả năng tổng hợp các enzyme ngoại bào. Các enzyme PLA depolymerase đều thuộc nhóm enzym ngoại bào. Do vậy chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào có trong dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn T2.
3.4.1. Khả năng sinh amylase.
Viê ̣c xác đi ̣nh hoa ̣t tính của mô ̣t số enzym ngoa ̣i bào không chỉ giúp phân loa ̣i chủng vi sinh vật nghiên cứu mà còn dùng để đánh giá khả năng phát triển của chủng vi sinh vâ ̣t nghiên cứu ở môi trường có nguồn cacbon khác nhau . Amylase là enzyme thủy phân tinh bột . Cơ chế xúc tác của amylase là cắt đứt liên kết nô ̣i chuỗi trong phân tử tinh bô ̣t.
Kết quả trên hình 12 cho thấy ở các vị trí có chứa di ̣ch enzym và vị trí đối chứng nước đều không xuất hiện vòng khuếch tán . Kết quả này cho chúng tôi kết luâ ̣n , chủng vi khuẩn T 2 không có hoa ̣t tính enzym ngoa ̣i bào amylase . Điều này khác biệt với chủng xạ khuẩn XKG5 được phân lập từ kết quả trước đây của Nguyễn Quang Huy và cộng sự, chủng XKG5 tạo vòng sáng chứng tỏ chủng có hoạt tính amylase [13].
Hình 12. Hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn T2
3.4.2.Khả năng sinh cellulase
Kết quả nghiên cứu hoa ̣t tính cellulase cho thấy: dịch chiết ngoại bào của T 2 có hoạt tính cellulase . So với đối chứng nư ớc, các vị trí còn lại có chứa dịch chiết ngoại bào của vi khuẩn T 2 đều cho vòng sáng xung quanh (hình 13). Kích thước vòng phân hủy vào khoảng 0,8 cm cho thấy hoa ̣t tính cellulase của vi khuẩn T 2khá mạnh.
Theo Nguyễn Quang Huy và cộng sự [12, 13] các chủng vi sinh vật phân lập ở Việt Nam như chủng xạ khuẩn XKG5 và nấm Penicillium citrinum đều tạo vòng có đường kính lớn. Như vậy so với kết quả nghiên cứu điều đó chứng tỏ cả xạ khuẩn XKG5 và nấm Penicillium citrinum có hoạt tính cellulase khá mạnh so với chủng T2.
3.4.3.Hoạt độ catalase và protease
Catalase và protease là hai enzym thuộc nhóm thủy phân. Catalase là enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hóa H2O2 thành O2 và H2O. Trong khi đó , protease xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết peptit trong phân tử polypeptitvà protein đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin.
