Chương 3: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ MYCOTOXIN
3.2.3. Phương pháp ELISA
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
1. Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt
2. Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme.
3. Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu.
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate).
- Phương thức cố đinh không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa
- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra
Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng thể - kháng nguyên có thể sảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng thể - kháng nguyên. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra.
Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA.
a) Phương pháp ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính:
Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn.
Hình 3.2: Phương pháp ELISA gián tiếp
Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh.
Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme).
Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. Thêm cơ chất enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
Nhược điểm cơ bản: Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này.
b) Sandwich ELISA
Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau:
(1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể
(2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định
(4) Rửa đĩa, kháng kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi (5) Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đoán
(6) Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp ở bước 5)
(8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện.
(9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng kháng thể.
Hình 3.3: Kháng nguyên gắn với kháng thể
c) ELISA cạnh tranh
Việc xác định và định lượng mycotoxin được xác định bằng kỹ thuật ELISA
cạnh tranh.
Các giếng trong kỹ thuật ELISA được gắn một kháng thể sơ cấp chống lại mycotoxin. Các tác nhân phát hiện là một phức hợp đồng hóa trị của mycotoxin này và một enzyme thường sử dụng là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase.
Các tác nhân này được trộn chung với mẫu dịch chiết của mycotoxin và phức hợp này được cho vào trong giếng. Trong giếng đối chứng (không chứa mycotoxin trong mẫu), phức hợp mycotoxin – enzyme có thể gắn lên các kháng thể sơ cấp và sau đó thêm các cơ chất tạo màu, kết quả là hiện màu trong mẫu. Trong các giếng kiểm tra, các phân tử mycotoxin tự do trong dịch chiết cạnh tranh với các phức hợp
gắn trên các kháng thể sơ cấp. Nồng độ mycotoxin càng cao, phức hợp gắn trên kháng thể sơ cấp càng tí dẫn đến màu trong giếng càng nhạt.
Hình 3.4: Phương pháp ELISA cạnh tranh
