Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh

4. Nội dung nghiên cứu

1.3.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp dãy nồng độ trên môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (minimum inhibitor concentration- nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50% inhibitor concentration- nồng độ ức chế 50%), MBC (minimum bactericidal concentration- nồng độ tối thiểu diệt khuẩn).

Cá ch t i ến hàn h :

* Pha o ng m u thử

Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 4 nồng độ theo yêu càu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất là 128µg/ml.

* Thử hoạt tính

Lấy 10µl dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200µl dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ 5.105CFU/ml, ở 37oC/24h.

* ử kết quả

- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật.

- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường

nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.

IC(%) = 100 x

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hình 2.1. M u Đương quy

Mẫu thực vật: Cây Đương quy ( Angelica sinensis (Oliv) Diels) thu hái tại Bắc Hà – Lào Cai. Sau đó được ngâm trong ethanol, ethyl acetate, n-hexan, thu cao chiết phục vụ cho các bước nghiên cứu.

+ Bộ phận sử dụng: lá, thân, rễ.

+ Địa điểm thu mẫu: Bắc Hà – Lào Cai.

+ Mẫu thực vật được TS. Đỗ Thị Lan Hương, giảng viên khoa Sinh – KTNN trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 giám định. Các mẫu cây đương quy được thu lấy theo thời gian sinh trưởng và phát triển của cây 6 tháng (ĐQ4), 9 tháng (ĐQ3), 12 tháng (ĐQ2) và 16 tháng (ĐQ1).

2.2. Nội dung nghiên cứu

STT Các nội dung, công việc chủ yếu

cần thực hiện Kết quả phải đạt được Ghi chú

Nghiên cứu tài liệu, tìm hiểu về tình hình về cây đương quy, các tác dụng của cây đương quy được dân gian sử dụng và một số các hợp chất có trong cây.

Báo cáo tổng quan về thực vật có trong cây đương quy

Thu lấy mẫu cây đương quy theo độ tuổi sinh trưởng của cây đương quy tại một số hộ tại địa bàn huyện Bắc Hà.

Các mẫu cây đương quy theo thời gian trồng.

Tìm hiểu các phương pháp tách chiết các hợp chất hữu cơ từ cây đương quy và làm thực nghiệm

Các dịch chiết tổng từ cây đương quy theo thời gian trồng

Phân tích định tính một số nhóm hợp chất hữu cơ có trong cây đương quy

Bảng kết quả các nhóm chất có trong cây đương quy bằng phân tích định tính

Phân tích định lượng các hợp chất có trong cây đương quy của 02 nhóm hợp chất điển hình.

Kết quả hàm lượng từng hợp chất của 02 nhóm hợp chất điển hình.

Xác định hoạt tính sinh hóa của nhóm chất điển hình đã phân tích định lượng của mẫu cây đương quy có hàm lượng cao nhất.

Kết quả đánh giá hoạt tính sinh hóa của 1-2 nhóm chất có trong cây đương quy.

2.3 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ

* Nguy n iệu:

Cây đương quy được trồng ở khu vực huyện Bắc Hà. Nguyên liệu được nhóm nghiên cứu thu trong điều kiện thời tiết khô ráo, không bị sâu bệnh vào thời gian 18/10/2018, sau đó đã được nhóm nghiên cứu tách chiết các hợp chất có trong cây đương quy. Các mẫu cây đương quy được thu lấy theo thời gian sinh trưởng và phát triển của cây 6 tháng (ĐQ4), 9 tháng (ĐQ3), 12 tháng (ĐQ2) và 16 tháng (ĐQ1).

* Hóa chất, dụng cụ

- Hóa chất: C2H5OH, CH3COOC2H5, HCl, H2SO4, FeCl3, Mg, Pb(CH3COO)2, I2, KI, HNO3, Bi(NO3)3, NaOH, Na2CO3, KOH, Fe2(SO4)3, ...

- Thiết bị, dụng cụ: Bình nhựa 5 lít đựng mẫu ngâm chiết, phễu thủy tinh, giấy lọc, bình cầu các loại, chậu thủy tinh, cố thủy tinh các loại, bình tam giác các loại, bình chiết, cân phân tích, pipet, ...

2.4. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp chiết xuất mẫu:

Mẫu cây đương quy được loại bỏ các lá khô, hỏng và rửa sạch. Củ và lá được thái nhỏ, lát mỏng, sau đó mẫu đương quy được phơi sấy khô ở nhiệt độ 30 - 32oC ngoài trời râm mát, tránh ánh nắng trực tiếp buổi trưa.

Sử dụng các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau để tách một số phân đoạn dịch chiết từ các hoạt chất thiên nhiên từ cây Đương quy (Angelica sinensis).

Ngâm cây Đương quy đã sấy khô trong trong ethanol 96% trong thời gian 7 ngày rồi đổ lượng dịch thu được ra bình và bảo quản. Dịch chiết thu được đem cô đặc dưới bóng đèn sợi đốt (tránh nhiệt độ cao làm biến tính các hợp chất có trong mẫu và tránh cho sự bay hơi của ethanol quá nhanh) tạo thành dạng cao và bảo quản trong tủ lạnh.

Cặn chiết thu được đem chiết phân bố trong nước với dung môi n- hexan sau đó thu dịch chiết n-hexan .

Cặn chiết thu được đem chiết phân bố trong nước với dung môi ethylacetate trong vòng 10 ngày sau đó thu dịch chiết và cô dưới đèn sợi đốt như trên tạo thành dạng cao và bảo quản trong tủ lạnh.

Hình 2.2. Hình ảnh thực tế ấy m u và tiến hành ọc, chiết m u đương quy

Định tính các hợp chất tự nhiên có trong cặn chiết đương quy (ĐQ) [6] Các cặn chiết ĐQ1 ÷ ĐQ4 được hòa tan trong các dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính các nhóm chất và thực hiện các phản ứng nhận biết định tính một số nhóm chất hữu cơ có trong mẫu cây đương quy như sau:

Nhóm chất Thuốc thử/ Dấu hiệu nhận biết phản ứng

Flavonoid

Wilstater

Màu vàng, xanh, đỏ xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.Màu tím xuất hiện chứng tỏ có lencoantoxyanidin.

Mg/ HCl

H2SO4 đặc

Phản ứng cho màu vàng tươi cho thấy sự có mặt của flavon, flavonol, màu vàng cam cho thấy sự có mặt của flavonon, màu đỏ hoặc tím cho thấy sự có mặt của chalcon, auron.

Dung dịch kiềm

Phản ứng cho màu vàng cho thấy sự có mặt của flavon, flavonol; màu tím cho thấy sự có mặt của chalcon; màu cam, đỏ cho thấy sự có mặt của flavon, isofavonon; màu cà phê cho thấy sự có mặt của flavonol; màu xanh cho thấy sự có mặt của autoxyanin.

Chì acetate 10% Phản ứng cho màu vàng là dương tính.

Alkaloid

Bouchardat Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu đỏ thẫm.

I2 + KI + H2O

Dragendorff Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu da cam.

Coumarin

NaOH 10% Phản ứng dương tính nếu xuất hiện hỗn hợp

màu vàng.

FeCl3 Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh.

Muối diazoni Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu vàng,

cam, đỏ cam, hồng, đỏ. trong alcohol

Tannin

Vanilin/ H2SO4 Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu đỏ đậm.

gelatin 5% +

Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện kết tủa. NaCl 1%

Pb(CH3COO)2

Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện kết tủa. 10%

Glycoside

Baljet Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu

vàng cam hoặc hồng xỉn.

Kedde Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu hồng

tím.

Raymond Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu tím

hoặc xanh.

Tollens Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện kết tủa.

Bortrager/ KOH Phản ứng cho màu đỏ, tím hoặc xanh lục

cho thấy sự có mặt của quinone.

Dung dịch kiềm Phản ứng cho màu vàng chứng tỏ có các polyphenol khác nhau.

polyphenol

FeCl3/ HCl Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.

Rosenheim Phản ứng cho màu xanh dƣơng cho thấy sự

có mặt của saponin triterpen.

Terpenoid Salkowski Phản ứng cho màu đỏ đậm, xanh, tím cho

thấy sự có mặt của steroid. và steroid

Liebermann Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu đỏ

hoặc xanh cho thấy sự có mặt của steroid và terpenoid.

- Burchardt Phenol và

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Quy trình tách các phân đoạn dịch chiết từ cây Đương quy

Để khảo sát thành phần hóa học của cây Đương quy, chúng tôi sử dụng ethanol 96% chiết rút thu được cao ethanol, tương tự như vậy chúng tôi sử dụng với các dung môi khác là n-hexan, ethylacetate. Quy trình chiết rút được mô tả ở hình 3.1, kết quả chiết rút được thể hiện ở bảng 3.2.

Mẫu đương quy A. sinensis

Chiết ethanol ĐQ1 – cặn EtOH Bổ sung nước Bổ sung n-hexane Cặn ĐQ1-H ĐQ1 - Cặn H2O Bổ sung nước Bổ sung EtOAc Cặn ĐQ1-E ĐQ1 - Cặn H2O

Hình 3.1. Quy trình tách chiết các hợp chất bằng dung môi

Cặn chiết thu được đem chiết phân bố trong nước với dung môi n- hexan sau đó thu dịch chiết n-hexan .

Các mẫu cây đương quy ĐQ2, ĐQ3 và ĐQ4 cũng làm tương tự và thu được các cặn chiết tương ứng.

Bảng 3.1. Khối lượng mẫu thu được khi chiết qua các phân đoạn và hiệu suất quá trình chiết đương quy

Phân đoạn Khối lượng (gam) Hiệu suất chiết (%) Phân đoạn Khối lượng (gam) Hiệu suất chiết (%) ĐQ1 23,69 9,44 ĐQ3 10,16 4,06 ĐQ1-H 4,99 1,99 ĐQ3-H 0,53 0,22 ĐQ1-E 0,78 0,32 ĐQ3-E 1,35 0,62 ĐQ1-H2O 17,02 6,81 ĐQ3-H2O 7,98 3,2 ĐQ2 26,89 10,76 ĐQ4 4,39 1,76 ĐQ2-H 3,76 1,51 ĐQ4-H 0,36 0,16 ĐQ2-E 1,64 0,66 ĐQ4-E 0,13 0,052 ĐQ2-H2O 20,65 8,26 ĐQ4-H2O 3,38 0,13

Từ hình 3.1 và bảng 3.2 chúng ta thấy rằng trong số các phân đoạn (PĐ) trên:

Đối với ĐQ1, PĐ có hiệu suất chiết rút cao nhất là của PĐ ethanol (9,44%), tiếp đến là cao PĐ H2O (6,81%), tiếp đến là cao PĐ n-hexan (1,99%), cao PĐ ethylacetate có hiệu suất chiết rút (0,32%) là thấp nhất.

Đối với ĐQ2, PĐ có hiệu suất chiết rút cao nhất là của PĐ ethanol (10,76%), tiếp đến là cao PĐ H2O (8,26%), tiếp đến là cao PĐ n-hexan (1,51%), cao PĐ ethylacetate có hiệu suất chiết rút (0,66%) là thấp nhất.

Đối với ĐQ3, PĐ có hiệu suất chiết rút cao nhất là của PĐ ethanol (4,06%), tiếp đến là cao PĐ H2O (3,2%), tiếp đến là cao PĐ ethylacetate (0,62%), cao PĐ n-hexan có hiệu suất chiết rút (0,22%) là thấp nhất.

Đối với ĐQ4, PĐ có hiệu suất chiết rút cao nhất là của PĐ ethanol (4,06%), tiếp đến là cao PĐ n-hexan (0,16%), tiếp đến là cao PĐ H2O (0,13%), cao PĐ ethylacetate có hiệu suất chiết rút (0,22%) là thấp nhất.

3.2. Định tính một số nhóm chất tự nhiên có trong mẫu đương quy

Các cặn chiết ĐQ1 ÷ ĐQ4 được hòa tan trong các dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính các nhóm chất và thực hiện các phản ứng nhận biết định tính một số nhóm chất hữu cơ có trong mẫu cây đương quy như sau:

Bảng 3.2. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất có trong các cặn chiết

Nhóm chất Thuốc thử/ Hiện tượng ĐQ1 ĐQ2 ĐQ3 ĐQ4

phản ứng

Flavonoid

Wilstater Xuất hiện các

++ ++ + +

Mg/ HCl màu vàng, xanh,đỏ đến tím

H2SO4 đặc màu vàng tươi,

vàng cam, đỏ ++ ++ + +

Alkaloid Bouchardat Xuất hiện kết + - + -

Dragendorff Xuất hiện màu

cam - đỏ - vàng. + + + +

Coumarin NaOH 10% Hỗn hợp xuất ++ ++ + +

hiện màu vàng

Tanin Pb(CH3COO)2 Hỗn hợp xuất + + + +

10% hiện kết tủa

Glycoside Baljet

Không có màu

+ + + +

đặc trưng

Dung dịch kiềm Hỗn hợp xuất + - + -

Phenol và hiện màu vàng

polyphenol

FeCl3/ HCl Xuất hiện màu

xanh lục, xanh + + + +

Terpenoid Liebermann Xuất hiện màu

đỏ hoặc xanh

++ ++ + +

Steroid - Burchardt + + - -

Ghi chú: (–) không có phản ứng đặc trưng (+) có phản ứng đặc trưng

Từ kết quả của các phản ứng định tính ta thấy thành phần các hợp chất tự nhiên có trong cây Đương quy khá phong phú bao gồm: Flavoid, Coumarin, Alkaloid, Tanin, Glycoside, Phenol và polyphenol, Terpenoid, Steroid. Hầu hết các phản ứng ở các nhóm chất đều là dương tính. Các chất thấy với hàm lượng nhiều là Flavonoid và Coumarin; các chất còn lại có nhưng với làm lượng ít hơn. Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hướng để tiếp tục nghiên cứu ở mức độ cao hơn.

3.3. Định lượng các nhóm chất có trong cây đương quy

Sau khi phân tích định tính các nhóm chất có trong các cặn chiết của mẫu đương quy ĐQ1 ÷ ĐQ4 ta thấy các nhóm hợp chất flavonoid và

coumarin là điển hình có trong các cặn chiết ethanol, dựa vào các tính chất đặc trưng của những nhóm chất đó các cặn chiết được chiết phân bố trong nước lần lượt với n-hexane và ethyl acetate để tách riêng các nhóm chất đó thu được các cặn chiết của EtOAc và các mẫu này được gửi xuống Trung tâm Phát triển công nghệ sạch và vật liệu - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam để đánh giá định lượng 2 nhóm hợp chất flavonoid và coumarin có trong cặn chiết của EtOAc. Kết quả được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.3. Thành phần hóa học của các dịch chiết từ cây đương quy

STT Thành phần hóa học ĐQ1 ĐQ2 ĐQ3 ĐQ4 1 Kaempferol 3,83 4,33 2,47 1,08 2 Quercetin 2,87 4,87 2,98 1,12 3 Rutin 1,36 1,61 1,02 0,82 4 Baicalin 0,812 1,12 0,62 0,38 5 Hyperoside 0,26 0,56 0,26 0,08 6 2″-O-(2″′-Methylbutyryl)- isoswertisin 0,18 0,35 0,29 0,09 7 Coumarine 2,89 3,96 1,89 1,2 8 Scopoletin 1,31 2,89 0,09 0,03 9 Umbelliferon 1,13 2,32 0,9 0,12 10 Eleutheroside B1 0,56 0,87 0,69 0,03 11 Isoimperatorin 0,65 0,85 0,58 0,32 12 Imperatorin 0,89 0,91 0,42 0,21 13 Bergapten 0,32 0,87 0,02 0,012 14 6-methoxycoumarin 0,61 0,43 0,21 0,02 15 6-methoxy-7-hydroxycoumarin 0,56 0,76 0,36 0,22

Từ bảng 3.3 ở trên ta thấy, trong các mẫu cặn ĐQ1-E ÷ ĐQ4-E, hàm lượng của các hợp chất có trong flavonoid và coumarin ở hai mẫu cặn chiết ĐQ1-E và ĐQ2-E nhiều hơn ở hai mẫu cặn chiết ĐQ3-E và ĐQ4-E. Trong đó, hàm lượng các hợp chất có trong flavonoid và coumarin ở mẫu cặn ĐQ2

nhiều hơn ở mẫu cặn ĐQ1-E. Ví dụ như hàm lượng của hợp chất Kaempferol

ở ĐQ2-E là4,33, ở ĐQ1-E là 3,83; hàm lượng của hợp chất Scopoletin ở ĐQ2-E là 2,89, ở ĐQ1-E là 1,31; hàm lượng coumarine của ĐQ2-E là 3,96, của ĐQ1-E là 2,89.

Điều này cho thấy, khi cây đương quy được trồng ở thời gian sinh trưởng và phát triển dài hơn thì có hàm lượng một số các hợp chất flavonoid và coumarine lớn hơn. Vì vậy, muốn tăng hàm lượng các hợp chất có lợi từ cây đương quy thì cần phải có thời gian trồng khoảng 12 tháng, sau đó mới thu hoạch sản phẩm.

3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học

3.4.1. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa

Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH

TT Tên mẫu

% có hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH tương ứng nồng độ (g/ml) Giá trị EC50 (g/ml) 512 256 128 64 32 1 ĐQ1-E 57 43 25 10 0 384,0 2 ĐQ2-E 77 64 41 28 10 178,1 Quercetin 8,23

Dựa vào kết quả đánh giá thử hoạt tính chống oxy hóa gốc tự do (DPPH), ta thấy 2 mẫu cặn chiết ĐQ1- E và ĐQ2- E đều có thể hiện hoạt tính chống oxy hóa (DPPH) ở các nồng độ 256 và 512 µg/ml cặn chiết. Trong đó, mẫu ĐQ2 (64-77%) có khả năng chống oxy hóa cao hơn mẫu ĐQ1 (43-57%), kết quả này cho thấy sự phù hợp với kết quả phân tích hàm lượng các hợp chất trong nhóm flavonoid và coumarin ở trên (cặn ĐQ2 > cặn ĐQ1).

3.4.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh

Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh

Tên mẫu ĐQ1-E ĐQ2-E

Gram (+) Staphylococcus >512 >512 aureus Bacillus >512 >512 subtilis Lactobacillus >512 >512 Giá trị IC50 fermentum đối với Gram (-) Salmonella >512 >512 các chủng enterica (g/ml) Escherichia >512 >512