Phương pháp phổ hồng ngoại (fourier transformation- 123docz.net

3. Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu về đặc tính của hydroxyapatite

3.4. Phương pháp phổ hồng ngoại (fourier transformation infrared

spectrophotometer, FTIR)

Quang phổ hồng ngoại, còn được gọi là phân tích FTIR hoặc quang phổ FTIR, là một kỹ thuật phân tích được sử dụng để xác định cấu trúc các vật liệu vô cơ, hữu cơ. Phương pháp phân tích FTIR sử dụng ánh sáng hồng ngoại để quét các mẫu thử và quan sát các tính chất hóa học [34].

3.4.1. Mục đích

 Nhận biết các chất;  Xác định độ tinh khiết;  Phân tích định lượng.

3.4.2. Nguyên lí hoạt động và nguyên tắc tạo ảnh của phương pháp FTIR

Ánh sáng từ nguồn chiếu vào chùm phân chia, làm tách thành 2 phần bằng nhau, một phần chiếu vào gương M1 và một phần khác chiếu vào gương M2, sau đó phản xạ lại trở qua chùm phân chia S, một nữa trở về nguồn, còn một nữa chiếu qua mẫu đi đến detecter. Do gương M1 di động làm cho đoạn đường của tia sáng đi đến

gương M1 rồi quay trở lại có độ dài lớn hơn đoạn đường tia sáng đi đến gương M2 rồi quay trở lại và được gọi là sự trễ. Do sự trễ này đã làm ánh sáng sau khi qua giao thoa kế biến đổi từ số cao đến tần số thấp. Sau đó ánh sáng đi qua mẫu hấp thụ một phần rồi đến detecter, ta nhận được một phổ hồng ngoại [34].

3.5. Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng TGA

Phân tích nhiệt trọng lượng hoặc phân tích nhiệt lượng (TGA) là một phương pháp phân tích nhiệt trong đó thay đổi tính chất vật lý và hóa học của vật liệu được đo như là một hàm của nhiệt độ (với tốc độ gia nhiệt không đổi), hoặc là một hàm thời gian (với nhiệt độ không đổi / hoặc mất khối lượng liên tục).

3.5.1. Phân loại phân tích nhiệt trọng lượng nhiệt TGA

Phân loại [38]:

 TGA đẳng nhiệt hoặc tĩnh: Trong kĩ thuật này, mẫu được duy trì ở nhiệt độ không đổi trong một khoảng thời gian ở đó ghi lại sự thay đổi trọng lượng.  TGA tĩnh bán phần: Trong kỹ thuật này, mẫu được gia nhiệt đến khối lượng

không đổi ở mỗi một loạt nhiệt độ tăng dần.

 TGA động: Trong loại phân tích này, mẫu phải chịu điều kiện nhiệt độ tăng liên tục với tốc độ gia nhiệt không đổi, tức là, thường tuyến tính theo thời gian.

3.5.2. Nguyên lí làm việc của phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng TGA

Mẫu đo được đặt vào trong giá đỡ. Ban đầu, cân ở vị trí cân bằng ( tức là chỉ số 0). Nhiệt độ được tăng lên nhờ thiết bị điều khiển. Trong quá trình tăng nhiệt độ, các quá trình lý hoá xảy ra trong mẫu đo dẫn tới sự thay đổi khối lượng của nó, sự thay đổi này nhờ các cảm biến khối lượng chuyển tín hiệu về máy tính để lưu trữ và chuyển đổi thành phần trăm khối lượng của vật liệu bị.

Dữ liệu đo nhiệt độ được thu thập từ phản ứng nhiệt được tổng hợp thành một giản đồ khối lượng hoặc phần trăm khối lượng ban đầu trên trục y so với nhiệt độ hoặc thời gian trên trục x. Biểu đồ này, thường được biểu diễn trên mặt phẳng, được gọi là đường cong TGA.

B. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng phế phẩm vảy cá rô phi (Oreochromis niloticus ), được thu mua sau quá trình phi lê ở siêu thị Lotte Mart Nha Trang, phường Phương Sơn, thành phố Nha Trang. Vảy cá sau khi thu nhận được rửa sạch, phơi khô. Sau đó bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 2.2.1. Dụng cụ 2.2.1. Dụng cụ

– Bình định mức 100 ml – Chén nung, ống nghiệm – Đũa thủy tinh

– Đĩa pettri 40 x 12 mm

– Cốc thủy tinh 250 ml và các dụng cụ khác.

2.2.2. Thiết bị

– Cân phân tích điện tử – Tủ sấy UNB 400 – Tủ nung – Bình hút ẩm – Máy khuấy từ 2.2.3. Hóa chất – NaOH – HA thương mại

– Methanol, chloroform, NaCl – CuSO4 khan

– KNaC4H6O6.4H2O khan – EDTA

– NaH2PO4, C6H8O7 – HCl, KCl

29 – Murexid

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.3. Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung 2.3.3.1. Nguyên tắc

Nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra hàm lượnng khoáng toàn phần trong nguyên liệu [41].

2.3.3.2. Cách tiến hành

Ban đầu, ta sấy cốc ở nhiệt độ không đổi. Cân 1g mẫu HA (thu nhận từ vảy cá rô phi) cho vào chén sứ để nung. Nung ở nhiệt độ thích hợp đến trọng lượng không đổi. Nung đến khi mẫu hóa tro, tức đã loại bỏ các hợp chất hữu cơ có trong vảy. Sau đó, cho vào tủ sấy khoảng 30 phút. Rồi cho vào bình hút ẩm 10 phút. Cuối cùng cân lượng mẫu còn lại sau khi nung [41].

2.3.3.3. Kết quả xác định hàm lượng khoáng

X=𝑀1 − 𝑀2

𝑀1−𝑀 x100 (%).

Trong đó:

X : Hàm lượng khoáng (%);

M1: Khối lượng chén nung và mẫu (g);

M2: Khối lượng chén nung và mẫu sau khi nung (g); M: Khối lượng chén nung (g).

2.4. Quy trình thu nhận hydroxyapatite từ vảy cá rô phi 2.4.1. Tiền xử lí nguyên liệu

2.4.1.1. Mục đích

Loại bỏ protein và các tạp chất khác trong vảy cá rô phi để thu được mẫu vảy sạch, sẵn có, để phục vụ cho quá trình thu nhận hydroxyapatite.

2.4.1.2. Tiến hành

– Vảy cá đem rửa sạch sau đó phơi khô, bảo quản ở nhiệt độ phòng. – Khử lipid, protein, và các hợp chất hữu cơ khác bằng NaOH.

Quá trình khử protein từ phế liệu thủy sản có thể được thực hiện với nhiều hóa chất như NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH,…Tuy nhiên NaOH được sử dụng nhiều nhất từ 110%, trong nghiên cứu này sử dụng NaOH 5% (w/v). Để tăng cường quá trình tách protein và hợp chất hữu cơ, cần kết hợp khuấy đảo trong nhiều giờ.

Vảy cá sau khi đã xử lí, cho vào cốc 250ml. Sau đó cho 100ml dung dịch NaOH 5% (w/v) vào cốc chứa vảy cá. Lượng NaOH 5% cho vào đến khi ngập tràn vảy cá. Sau đó kết hợp khuấy từ, đun nóng ở 70oC khoảng 5h.

– Rửa sạch vảy cá đã loại bỏ protein và hợp chất hữu cơ khác bằng nước cất sạch

Sau khi xử lí kiềm trong 5h, ta tiến hành rửa bằng nước cất nhiều lần đến khi pH=7.

– Sấy mẫu vảy cá đã được loại protein  Bảo quản mẫu trong bình hút ẩm

Hình 2.1. Bảo quản vảy cá (đã loại bỏ protein) sau sấy trong bình hút ẩm. 2.4.2. Thu nhận hydroxyapatite

2.4.2.1. Mục đích

– Thu nhận hydroxyapatite

2.4.2.2. Tiến hành

Sử dụng tủ nung, tiến hành nung ở các nhiệt độ khác nhau (600, 700, 750, 800, 900, 1000oC) trong 3h với tốc độ gia nhiệt 5oC/phút.

C. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2. Đánh giá hydroxyapatite qua các nhiệt độ nung khác nhau 2. Đánh giá hydroxyapatite qua các nhiệt độ nung khác nhau

2.1. Hiệu suất thu hồi hydroxyapatite ở các nhiệt độ nung khác nhau bằng phương pháp nung phương pháp nung

Xương cá sau khi nung ở các nhiệt độ 600, 700, 750, 800, 900, 1000oC thu được HA. Sự thay đổi HA được thể (Bảng 3.2).

Ở 600oC HA có màu xám, chứng tỏ lượng tạp chất hữu cơ, còn trong vảy cá nên HA không tinh khiết. Điều này được thể hiện trong nghiên của Muhammad A. và cộng sự (2013), cho thấy khi nung ở nhiệt độ 500oC600oC hợp chất hữu cơ chưa bị đốt cháy hoàn toàn, còn chứa nhiều protein, collagen,… nên mẫu HA vẫn có màu xám nhạt [14].

Ở 700750oC HA có màu trắng, có thể đã loại hết các hợp chất hữu cơ, cảm quan thấy độ tinh khiết cao.

Dựa trên đánh giá cảm quan và hiệu suất thu hồi HA qua các nhiệt độ khác nhau, nhận thấy vảy cá nung ở 750oC trong 3h với tốc độ gia nhiệt 5oC/phút (Hình 3.1) có tính khả quan hơn các mẫu khác.

Hình 3.1. Vảy cá sau khi nung (đã nghiền) trong 3h với tốc độ gia nhiệt 5oC/phút.

2.2. Hiển vi điện tử quét (SEM) của hydroxyapatite ở các nhiệt độ nung khác nhau

Mẫu HA được đem đi chụp SEM để xác định hình dạng, kích thước ở các nhiệt độ khác nhau.

Quan sát SEM, nhiệt độ tổng hợp ảnh hưởng đến kích thước hạt của HA. Khi tăng nhiệt độ từ 6001000oC, thì kích thước hạt HA tăng dần.

Khi nung ở 600oC, tinh thể hạt chưa được xác định rõ, kích thước không đều, một số hạt HA chưa tách rời khỏi nhau. Khi nung từ 700750oC, hạt HA có dạng hình cầu, kích thước hạt dao động khoảng 60100nm, các hạt HA bắt đầu tách rời khỏi nhau. Khi nung khoảng 8001000oC, HA có dạng hình cầu rõ rệt, có kích thước lớn, và dần kết dính với nhau.

Do đó, khoảng nhiệt độ để thu nhận HA từ vảy cá rô phi thích hợp dao động từ 700750oC, ở khoảng nhiệt độ này, hạt có kích thước nhỏ và hình dạng được xác định rõ.

3. Kết quả chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Phân tích SEM, là một trong những phương pháp khá đơn giản, cho biết hình dạng, kích thước hạt một cách nhanh chóng. Dựa vào kết quả SEM, chỉ ra được hạt HA thu được từ vảy cá rô phi có dạng hình cầu, kích thước dao động khoảng 60100nm; các hạt tách rời khỏi nhau (Hình 3.5). Đối với ảnh chụp SEM mẫu HA tổng hợp thương mại (Hình 3.6), hạt HA cũng có hình cầu, kích thước hạt dao động khoảng 5090nm ở thước đo 500nm và các hạt tách rời khỏi nhau.

Mặc khác, trong nghiên cứu của Weeraphat PonOn và cộng sự (2016) (Hình 3.7), khi thu nhận hạt HA từ vảy cá nước ngọt, kích thước hạt thu được dao động trong khoảng 50100nm, các hạt hình cầu cũng dần tách rời khỏi nhau [20].

Hình 3.2. Ảnh chụp SEM của HA thu nhận từ vảy cá.

Từ đó kết luận, mẫu HA thu được từ vảy cá rô phi có kích thước gần giống với HA thương mại (Sigma Aldrich, Mỹ).

4. Kết quả chụp hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Phân tích ảnh chụp TEM cho thấy được kích thước hạt và hình dạng cấu trúc bên trong của vật liệu (Hình 3.8). Với mẫu HA thu nhận từ vảy cá rô phi ảnh chụp TEM cho thấy kích thước hạt dao động khoảng 60100nm ( gần giống kích thước hạt khi xác định bằng phương pháp SEM). Hạt HA thu được từ vảy cá rô phi có cấu trúc

Từ đó chỉ ra được, HA thu nhận từ vảy cá rô phi với HA thương mại (Sigma Aldrich) có tính tương đồng cao.

5. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (FTIR)

Phổ FTIR cho thấy sự hiện diện của các ion photphat (PO43−), hydroxyl (OH−) và carbonate (CO32−) trong HA thu nhận từ vảy cá rô phi.

Tại vị trí có số sóng thuộc khoảng 20002400cm1, là vùng hấp thụ của CO2, bên cạnh đó vùng có số sóng thuộc khoảng1400−1600cm−1, với tín hiệu yếu đặc trưng cho dao động giãn bất đối xứng của các nhóm CO32−. Sự xuất hiện của peak CO32− có thể là do CO2 không khí đã chuyển thành ion CO32− trong quá trình loại protein và lipid bởi dung dịch kiềm. Ở mẫu HA thương mại cũng có tín hiệu CO32−.

Khi so sánh vởi phổ FTIR của HA thì ta thấy các tín hiệu thu được gần như giống nhau. Chứng tỏ có độ tinh khiết tương đối cao.

Hình 3.3. Phổ FTIR của vảy cá (Labeo rohita). 6. Kết quả phân tích nhiễu xạ tia X (XRD)

Quan sát trên phổ XRD của HA từ vảy cá rô phi (Hình 3.14 a) thấy có các tín hiệu đặc trưng của tinh thể HA theo nghiên cứu Yung Mo Sung và cộng sự (năm 2003) (Hình 3.13) ở các vị trí 002, 210, 211, 112, 300, 202, 310, 321, 410, 004.

Khi so sánh phổ XRD của HA từ vảy cá rô phi với HA thương mại (Sigma Aldrich, Mỹ) (Hình 3.14) cũng nhận được sự tương đồng cao, cũng xuất hiện các tín hiệu đặc trưng 002, 210, 211, 112, 300, 202, 310, 321, 410, 004. Điều đó chứng tỏ nghiên cứu này đã tổng hợp thành công tinh thể HA từ vảy cá rô phi.

Tuy nhiên, bên cạnh đó, vẫn xuất hiện một số tín hiệu liên quan đến βTCP ở các vị trí 125, 0210, 0410. Do đó, mẫu HA thu nhận từ vảy cá rô phi chưa đơn pha do có lẫn βTCP với một lượng rất thấp. Như vậy, mặc dù theo các nghiên cứu

trước công bố ở 8001200oC, HA dễ bị phân hủy thành các dạng, nhưng nghiên cứu này chỉ ra ở 750oC cũng đã bắt đầu có sự xuất hiện của βTCP. Do đó, mẫu HA thu nhận từ vảy cá rô phi có độ tinh khiết tương đối, chưa hoàn toàn đơn pha do có lẫn βTCP với một lượng rất thấp.

 Xác định kích thước trung bình của tinh thể HA thu nhận từ vảy cá rô phi bằng phương trình Scherrer (Mục 3.3.4.1)

+ Trong phổ XRD của HA thu nhận từ vảy vá rô phi (Hình 3.14 a), tại vị trí 2 =31,768; Kích thước trung bình của tinh thể thu được 0,060nm.

+ Dựa vào công thức đó có thể làm tương tự đối với HA thương mại (Hình 3.14 b), tại vị trí 2=31,691; ta cũng suy ra được kích thước tinh thể trung bình mà HA (Sigma Aldrich) thu được là 0,03nm.

 Xác định cấu trúc của HA thu nhận từ vảy cá rô phi

Có thể thấy rằng HA thu nhận từ vảy cá rô phi có kích thước đơn vị với a=b= 9,384Ao (9,44) và c= 6,88Ao. Kết quả này tương tự như các nghiên cứu chỉ ra XRD có cấu trúc lục phương với kích thước đơn vị a=b=9,43Ao, c=6,88Ao. Một số nghiên cứu trước cũng chỉ ra rằng cấu trúc mạng tinh thể HA gồm các ion Ca2+, PO43 và OH được sắp xếp theo dạng hình lục phương kích thước tế bào. Cấu trúc của một ô đơn vị HA được hiển thị dưới đây:

7. Kết quả phân tích nhiệt trọng lượng (TGA)

Dựa trên kết quả phân tích nhiệt của HA thu nhận từ vảy cá rô phi cho thấy xuất hiện hai điểm uốn. Tại điểm uốn có nhiệt độ 300oC có thể do sự bay hơi của nước trong quá trình gia nhiệt. Tại điểm uốn có nhiệt độ 500oC, có thể do loại bỏ một phần các hợp chất hữu cơ có trong mẫu. Từ khoảng nhiệt độ 600800oC không có sự thay đổi về khối lượng.

Kết quả thu được cũng gần giống với tài liệu khi chỉ ra rằng HA thường đối bền với. Mặc khác, khi so sánh nghiên cứu với kết quả nghiên cứu trước đó về tổng hợp HA bằng phương pháp siêu âm. Trong khoảng nhiệt độ 2, giảm đến 5% khối lượng đó là do quá trình mất hơi nước. Sau đó giảm nhẹ trong khoảng nhiệt độ 3.

Nhưng trong nghiên cứu này, khi so sánh mẫu HA (thu nhận từ vảy cá rô phi) với HA thương mại (Sigma Aldrich), kết quả thu được chỉ ra khoảng nhiệt độ mà HA không thay đổi về khối lượng hạn chế hơn so với HA thương mại (Sigma Aldrich).

Hình 3.4. Kết quả phân tích TGA của HA tổng hợp bằng phương pháp siêu âm [44].

8. Kết quả xác định độ tan của hydroxyapatite trong các dung dịch có pH từ 17

Khi cho bột HA (thu nhận từ vảy cá rô phi) vào các dung dịch có pH từ 17, kết quả quan sát như bảng sau (Bảng 3.5):

Cảm quan khi cho HA vào các dung dịch có pH khác nhau từ 17. Ở các dung dịch có pH=1 và pH=2, HA tan hoàn toàn, nên có thể dùng phương pháp chuẩn độ để chuẩn độ Ca2+. Các dung dịch có pH từ 37, đục, hầu như không tan, khi cho murexid vào lập tức chuyển sang màu tím. Có thể do ảnh hưởng của môi trường pH trong dung dịch, nên khi cho murexid vào đã chuyển màu, bởi khoảng giới hạn chuyển màu của murexid là [40]:

pH < 9 9 < pH < 11 pH > 11

Chỉ thị có màu đỏ tím Chỉ thị có màu tím Chỉ thị có màu xanh tím

Tiến hành chuẩn độ bằng EDTA với thuốc thử murexid ở các dung dịch có pH=17, thu được như sau (Bảng 3.6):

Tại pH=1 và pH=2, HA (thu nhận từ vảy cá rô phi) tan, nên có thể dùng phương pháp chuẩn độ để xác định nồng độ Ca2+. Tại pH= 3-7, HA đục và tan không tốt dẫn đến việc sử dụng phương pháp chuẩn độ không đủ nhạy để xác định nồng độ Ca2+. Vì độ tan rất thấp.

Dựa trên kết quả phân tích trên, tiến hành xác định độ tan của HA (thu nhận từ vảy cá rô phi), HA thương mại (Aldrich Sigma) trong môi trường có pH=1 và pH=2.

Từ kết quả cho thấy HA (thu nhận từ vảy cá rô phi) và HA thương mại (Sigma Aldrich) có độ tan gần như tương tự nhau trong môi trường pH=1.