II. TÁC DỤNG CỦA LÁ ỔI VÀ PHÂN LOẠI
3. Phân tích thành phần hóa thực vật
3.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học
3.2.1. Dịch chiết ether
o Xác định tinh dầu: Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cạn. Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ rồi lại bốc hơi cho đến cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng : Có tinh dầu.
Kết quả: Trong lá ổi có tinh dầu
o Xác định chất béo: Lấy vài giọt dịch chiết ether nhỏ lên cùng một chỗ trên một miếng giấy mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung môi ( và vết mờ có mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu). Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có hiện lên vết mờ: có chất béo.
Kết quả: Có chất béo trong lá ổi
HÌnh 33. Kết quả định tính tinh dầu
Vết mờ
30
Nguyễn Thành Lộc
o Định tính flavonoid: Các hợp chất flavonoid (flavanon, flavanonol, flavon, flavanol) trong dược liệu được định tính bằng phản ứng cyanidin. Lấy khoảng 10ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn khô. Hòa cắn với 2ml cồn và gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và them từ từ 0,5ml HCl đđ. Nếu sau phản ứng, dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: có flavonoid.
Kết quả: Có flavonoid trong dịch chiết ether 3.2.2. Dịch chiết cồn
o Định tính flavonoid: Các flavonoid có nhân ɣ-pyron và ɣ-dihydropyron (flavanon, flavanonol, flavon, flavanol) trong dược liệu được định tính bằng phản ứng cyaniding. Lấy khoảng 5ml dịch cồn cho vào chén sứ, bóc hơi còn khoảng 2ml và gạn dịch còn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và them từ từ 0,5ml HCl đđ. Nếu sau phản ứng, dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: có flavonoid.
Kết quả: Có flavonoid trong dịch chiết cồn
HÌnh 35. Kết quả định tính flavonoid trong dịch chiết ether
31
Nguyễn Thành Lộc
o Định tính tannin: lấy 2ml dịch chiết cho vào một chén sứ, bốt hơi tới cắn. Hòa tan cắn với 4ml nước trên bếp cách thủy. Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm.
✓ Ống nghiệm thứ nhất: pha loãng 0.5ml dịch chiết với 1ml nước cất. Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: Có polyphenol.
✓Ống nghiệm thứ hai: thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatin muối, lắt đều, so sánh với ống chứng chứa dịch chiếc ban đầu. Nếu có tủa bông trắng: có tannin.
Kết quả: Có tannin trong dịch chiết cồn
Hình 37. Kết quả định tính polyphenol trong dịch chiết cồn
Ống thử Ống chứng
Hình 37. Kết quả định tính polyphenol trong dịch chiết cồn
32
Nguyễn Thành Lộc
o Định tính saponin: Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô trên bếp cách thủy tới cắn. Hòa cắn trong 5ml cồn 25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm, Thêm 5ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bột bền: Có saponin.
Kết quả: Có saponin trong dịch chiết cồn 3.2.3. Dịch chiết cồn sau khi thủy phân
Một phần dịch chiết cồn được thủy phân để định tính các aglycon sau khi thủy phân. Lấy 15ml dịch chiết cồn cho vào bình nón 100ml, thêm 10ml HCl 10% đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút. Để nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic (15ml x 3 lần). Thu được dịch chiết ether được dùng để định tính các aglycon.
o Định tính flavonoid: Lấy khoảng 5ml dịch ether sau khi thủy phân cho vào chén sứ, bốc hới đến cắn, hòa cắn vào 2ml cồn và cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5ml HCl đđ. Nếu đun dịch có màu từ hồng tới đỏ: có flavonoid ( nhân ɣ-pyron).
Kết quả: Có flavonoid trong dịch chiết cồn sau khi thủy phân
Hình 38. Kết quả định tính saponin sau khi để yên 15 phút
33
Nguyễn Thành Lộc
3.2.4. Dịch chiết nước
o Định tính flavonoid: Định tính những chất có nhân ɣ-pyron và ɣ- dihydropyron. Lấy khoảng 5ml dịch nước cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn trong khoảng 2ml cồn 25% lọc vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5ml HCl đđ (phản ứng cyaniding). Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: Có flavonoid.
Kết luận: Có flavonoid trong dịch chiết nước
o Định tính glycoside tim: Định tính đường 2-desoxy: lấy 5ml dịch chiết nước bóc hới cho tới cắn. Hòa lại cắn với 5ml thuốc thử xanthydrol khuấy cho tan hết cắn, đậy uống nghiệm bằng nút bông gòn, cách thủy trong 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận: Có đường 2-desoxy.
Kết luận: Có thể có glycoside tim trong dịch chiết nước
Hình 39. Kết quả định tính flavonoid trong dịch chiết nước
Hình 40. Kết quả định tính saponin ( đường 2-desoxy)
34
Nguyễn Thành Lộc
o Định tính proanthocyanidin: Lấy 5ml dịch chiết nước vào ống nghiệm. Thêm 2ml dung dịch acid hydrochloric 10% và đun trên bếp cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ: có proanthocyanidin.
Kết luận: có proanthocyanidin trong dịch chiết nước
o Định tính tannin:
✓ Lấy 0,5ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: có polyphenol.
Hình 41. Kết quả định tính proanthocyanidin
35
Nguyễn Thành Lộc
✓ Lấy 2ml dịch chiết, thêm vào 5 giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều, so sánh với dung dịch ban đầu. Nếu có kết tủa bông trắng: Có tannin.
Kết luận: Có tannin trong dịch chiết nước
o Định tính saponin: Lấy khoảng 5ml dịch nước cho vào một chén sứ, đun cách thủy tới cắn khô. Hòa cắn với 5ml cồn 25% lọc vào ống nghiệm. Pha loãng với 5ml nước, lắc mạnh theo theo dọc của ống trong 15 giây. Nếu có cột bọt bền trong 15 phút: Có saponin.
Kết luận: Có saponin trong dịch chiết nước
Hình 42. Kết quả định tính polyphenol
36
Nguyễn Thành Lộc
o Định lượng hớp chất polyuronid: Nhỏ từng giọt 2ml dịch chiết nước vào ống nghiệm có chứa 10ml cồn 95% (hoặc aceton). Nếu có nhiều tủa bông được tạo thành: Có các polyuronid.
Kết luận: Có khá ít kết tủa được nhìn thấy. Nghi ngờ có polyuronid trong dịch chiết nước.
3.2.5. Dịch chiết nước sau khí thủy phân
Một phần dịch chiết nước được thủy phân để định tính các aglycon sau khi thủy phân. Lấy 15ml dịch chiết nước cho vào bình nón 100ml, thêm 10ml HCl 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút. Để nguội, Cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic (15ml x 3 lần). Dịch ether được dùng để định tính aglycon.
o Định tính flavonoid: Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn. Hòa cắn vào 2ml cồn 95% và cho vào một ộng nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5ml HCl đđ. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ: có flavonoid (các dẫn chất ɣ-pyron).
Kết luận: Có flavonoid trong dịch chiết nước thủy phân
Hình 43. Kết quả định tính polyuronid
Hình 44. Kết quả định tính flavonoid trong dịch chiết nước thủy phân
37
Nguyễn Thành Lộc
(-) Không có (±) Nghi ngờ (+) Có
Ghi chú: có thể phản ứng nhưng không thực hiện không có mặt của nhóm hợp chất trong dịch chiết Nhóm hợp chất Cách thực hiện Thuốc thử Phản ứng dương tính
Kết quả định tính trên các dịch chiết
Kết quả định tính chung Dịch chiết ete
Dịch chiết cồn Dịch chiết nước Không thủy phân Thủy phân Không thủy phân Thủy phân Chất béo Nhỏ dd lên giấy Vết trong mờ + Có Carotenoid Carr-Price Xanh→ đỏ
Không có H2SO4 Xanh dương hay lục→ xanh dương -
Tinh dầu Bốc hơi tới cắn Có mùi thơm + Có Triterpenoid tự do Liebermann-Burchard Đỏ nâu-tím, lớp trên có màu xanh lục - Không có Alkaloid T/thử chung alkaloid Kết tủa - - - Không có Coumarin Phát quang trong kiềm Phát quang mạnh hơn Nghi ngờ Anthraglycosid KOH 10% Dd kiềm có màu hồng tới đỏ Không có Flavonoid Mg/HCl đđ Dd có màu hồng tới đỏ + + + + + Có Anthraquinon NaOH 10% Lớp kiềm có màu hồng tới đỏ - - - Không có Glycosid tim Thuốc thử vòng lacton Tím
Nghi ngờ T/thử đường 2-desoxy Đỏ mận - + Anthocyanosid HCl Đỏ - Không có KOH Xanh Proanthocyanidin HCl/to Hồng tới đỏ + Có Tannin Dd FeCl3 Xanh rêu hay xanh đen (Polyphenol) + +
Có Dd gelatin muối Tủa bông trắng (Tannin) + +
Triterpenoid thủy
phân Liebermann-Burchard Đỏ nâu-tím, lớp trên có màu xanh lục - - Không có Saponin Tt Liebermann Có vòng tím nâu Có
Lắc mạnh dd nước Có bột bền + +
Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt - - Không có Chất khử T/thử Fehling Tủa đỏ gạch - - Không có Hợp chất polyuronic Pha loãng với cồn 90% Tủa bông trắng – vàng nâu ± Nghi Ngờ
38
Nguyễn Thành Lộc
4. Định tính tannin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
4.1. Quy trình chiết tannin để chấm sắc ký
Bản mỏng silicagen tráng sẵn GF254 (MERCK).hoạt hoá ở 1100C trong 1giờ ✓ Dung dịch thử: lấy 0,5g bột lá Ổi thêm 3ml methanol ngâm trong 15phút, thỉnh
thoảng lắc lọc lấy dịch lọc. Cô dịch lọc tới cắn, sau đó thêm một ít methanol. Tiến hành chấm
✓ Hệ dung môi khai triển: chloroform - ethyl acetat - acid formic (5:5:1)
✓ Có thể tiến hành với dung dịch đối chiếu acid gallic trong methanol (1ml chứa 1mg acid gallic )
✓ Soi với đèn UV với bước song 365 và bước song 254.
✓ Thuốc thử phun hiện màu: pha 10ml dung dịch FeCl3 5% trong ethanol. Tanin sẽ kết hợp với ion Fe3+ tạo ra phức chất có màu xanh, xanh lục hoặc xanh đen .
SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CHẤM SẮC KÝ TANIN TRONG BỘT LÁ ỔI
Dịch chiết ban đầu Cắn dịch chiết Dịch để chấm Ngâm trong Methanol Dung nhẹ trên bếp cách thủy Hòa cắn với methanol Bột dược liệu
39
Nguyễn Thành Lộc
Nhận xét: Khi soi ở bước sóng UV 254 ta thấy tách được sáu vết với sáu Rf
khác nhau. Còn soi ở bước song UV 365 không thấy hiện vết. Sauk hi phun FeCl3 5% trong ethanol ta thấy các vết bắt màu tím → Có tannin
Rf= 0,07 Rf= 0,14 Rf= 0,22 Rf= 0,28 Rf= 0,68 Rf= 0,76
Hình 45. Kết quả chấm sắc ký trước và sau khi phu thuốc thử FeCl3 5% trong ethanol UV 254 Phun FeCl3 5%
40
Nguyễn Thành Lộc
CHƯƠNG III
XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU ỔI
1. Định nghĩa
o Tên thường gọi: Cây ổi Còn gọi Là ủi, Phan thạch lựu, Guajava.
o Tên khoa học: Psidium guyjava L.
o Họ khoa học: Thuộc họ Sim Myrtaceae.
2. Mô tả
Ổi là một cây nhỡ cao chừng 3-5m, cành nhỏ thì vuông cạnh, lá mọc đối có cuống ngắn, hình bầu dục, nhẵn hoặc hơi có lông ở mặt trên, mặt dưới có lông mịn, phiến nguyên, khi soi lên có thấy túi tinh dầu trong. Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở kẽ lá. Quả là một quả mọng có vỏ quả giữa dày, hình dáng thay đổi tùy theo loài, ở đầu có sẹo của đài tồn tại. Rất nhiều hạt, hình thận, không đều, màu hơi hung.
3. Đặt điểm vi phẫu
3.1. Lá
3.1.1. Gân giữa
Vi phẫu mặt trên phẳng, mặt dưới lồi nhiều và tròn. Biểu bì 1 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều, biểu bì trên nhỏ hơn biểu bì dưới, lớp cutin khá dày, có nhiều lông che chở đơn bào vách rất dày. Mô dày góc, 5-6 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều, xếp lộn xộn. Mô mềm đạo, nhiều lớp tế bào hình đa giác hoặc gần tròn, kích thước to. Hệ thống dẫn hình cung có thể nối với 1-2 cung nhỏ hơn ở mỗi bên. Gỗ ở trên libe ở dưới. Gỗ, tế bào hình đa giác, kích thước không đều, xếp lộn xộn; mô mềm gỗ, tế bào hình đa giác nhỏ, vách tẩm chất gỗ, vài lớp phía dưới tế bào vách cellulose; libe, tế bào hình đa giác, vách uốn lượn, xếp lộn xộn; libe trong, 4-5 lớp tế bào hình đa giác, xếp thành cung liên tục phía trên gỗ. Mô dày góc 8-9 lớp tế bào hình đa giác góc tròn, xếp liên tục quanh bó dẫn. Sợi vách dày, xếp rải rác ngoài vòng mô dày. Túi tiết ly bào ở gần biểu bì của gân giữa và thịt lá. Tinh thể calci oxalat hình khối và hình cầu gai trong mô mềm và libe.
3.1.2. Phiến lá
Tế bào biểu bì trên hình chữ nhật, cutin mỏng. Tế bào biểu bì dưới kích thước gần bằng tế bào biểu bì trên, lỗ khí nhiều và nhô cao hơn biểu bì. Hạ bì 2-3 lớp tế bào hình chữ nhật, hóa mô dày góc. Mô giậu, 2-3 lớp tế bào thuôn có khoảng 3-4 tế bào dưới mỗi tế bào hạ bì. Mô mềm đạo 3-4 lớp, tế bào hình đa giác hay chữ nhật, chứa đầy lục lạp. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai có nhiều trong mô dày và mô mềm.
41
Nguyễn Thành Lộc
3.1.3. Cuống lá
Vi phẫu có mặt trên lõm dạng hình chữ V, mặt dưới lồi tròn. Biểu bì tế bào hình chữ nhật có lớp cutin khá dày, có nhiều lông che chở đơn bào vách rất dày. Mô dày góc 4-5 lớp xếp lộn xộn, hình dạng thay đổi. Nhiều túi tiết ly bào nằm gần biểu bì. Mô mềm tế bào hình đa giác, kích thước không đều, có nhiều tinh thể calci oxalat hình khối và hình cầu gai. Vài tế bào mô cứng hình đa giác trong mô mềm phía trên cung libe gỗ. Hệ thống dẫn giống gân giữa lá. Mô dày góc bao quanh cung libe gỗ.
3.2. Thân
Vi phẫu thân già tròn, thân non hình chữ nhật có 4 cánh ở 4 góc. Biểu bì 1 lớp tế bào hình chữ nhật, nhiều lông che chở đơn bào vách rất dày. Mô dày góc 2-3 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều. Thân non có nhiều túi tiết ly bào nằm gần biểu bì. Mô mềm vỏ đạo 4-5 lớp tế bào hình đa giác thuôn dài, hơi bị ép dẹp, kích thước không đều. Trụ bì 2-3 lớp tế bào hình đa giác, hoá mô cứng thành từng đám hay liên tục thành vòng. Tầng bì sinh xuất hiện dưới trụ bì tạo thành lớp bần ở ngoài có thể bị bong rách ở thân già và lục bì ở trong gồm vài lớp tế bào bị ép dẹp, xếp xuyên tâm. Hệ thống dẫn kiểu hậu thể liên tục. Libe 1 tế bào hình chữ nhật kích thước nhỏ, không đều, vách uốn lượn, xếp thành cụm. Libe 2 tế bào hình đa giác, xếp liên tục thành vòng. Gỗ 2 nhiều, mạch gỗ gần tròn hoặc đa giác, kích thước không đều; mô mềm gỗ tế bào hình đa giác, vách tẩm chất gỗ, có những vùng mô mềm gỗ có vách dày hơn tạo thành vòng thường chứa rất ít mạch gỗ. Gỗ 1 gồm 2-3 mạch, tế bào hình tròn, phân bố tương đối đều; mô mềm gỗ 1 hình đa giác, vách cellulose. Libe quanh tủy 4-5 lớp tế bào hình đa giác, vách uốn lượn, xếp thành vòng liên tục. Mô mềm tủy đạo, tế bào hình tròn hay bầu dục, kích thước không đều, càng vào trong càng to dần. Tinh thể calci oxalat hình khối hoặc hình cầu gai kích thước không đều có nhiều trong mô mềm tủy và libe 2, ít hơn trong mô mềm vỏ.
3.3. Bóc tách biểu bì
Lỗ khí kiểu song bào khi bóc tách biểu bì mặt dưới của lá
4. Đặt điểm bột lá ổi
Bột dược liệu lá non có màu xanh, vị chát, có lẫn sợi, gồm các thành phần sau : Mảnh biểu bì trên tế bào hình đa giác xếp khít nhau. Mảnh biểu bì dưới rất nhiều lỗ khí kiểu song bào. Mảnh mô mềm tế bào hình bầu dục vách mỏng. Mảnh mô mềm phiến lá gồm biều bì trên, mô giậu tế bào thuôn, mô mềm đạo. Mảnh mạch xoắn. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình khối. Lông che chở đơn bào nhiều, thường cong, vách rất dày.
5. Định tính
A. Chiết 5 – 10g dược liệu bằng nước trên bếp cách thủy trong 15 phút. Để nguội, lọc lấy dịch lọc làm phản ứng định tính. Nếu dung dịch có nhiều hợp