tây
- Hóa chất: H2SO4, NaCl
4. Phương pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp thu thập tài liệu
Đề tài nghiên cứu được thu thập tài liệu từ các bài giảng, báo cáo về quá trình sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm lớn Polypores , tạp chí trong và ngoài nước về phương pháp nuôi cấy và theo dõi sự phát triển để giữ giống hệ sợi nấm lớn Polypores
trong điều kiện Phòng thí nghiệm
4.2 . Phương pháp nuôi cấy
4.2.1 . Các môi trường nuôi cấy và theo dõi
Môi trường PDA
Môi trường PGA
Môi trường TH
Môi trường YMA
4.2.2 . Phương pháp cấy truyền
Sử dụng phương pháp cấy truyền và giữ giống để nhân giống sản xuất trong quá trình nuôi cấy
• Nuôi cấy ở các môi trường khác nhau để xác định được môi trường phù hợp.
• Cấy chuyền giống ra môi trường PDA nhằm cấy thuần nấm sau khi lấy mẫu ở để phục vụ cho công tác nghiên cứu kháng khuẩn sau này. Bảo quản giống giúp tránh sự nhiễm chéo trong công tác nghiên cứu cũng như bảo quản lượng giống có chất lượng tốt phục vụ cho quá trình cấy chuyền.
Tiến hành cấy chuyền:
- Cắt một miếng môi trường có agar hoặc móc sợi nấm chuyển sang môi trường mới bằng cách úp miếng agar có hệ sợi nấm lên mặt môi trường mới.
- Nuôi hệ sợi ở 30 - 33oC trong vài ngày. Quan sát sự phát triển hệ sợi nấm [3].
Hình 2.4. Phương pháp cấy chuyển [3]
• Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật
a) Cấy chuyền VSV sang đĩa Petri bằng que cấy
Sau khi có các khuẩn lạc VSV thuần chủng trên đĩa Petri, dùng que cấy để cấy chuyền chúng sang các môi trường tương ứng để nghiên cứu.
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối VSV thuần chủng, cấy chuyền sang môi trường thạch trong đĩa Petri.
b) Cấy chuyền VSV sang các ống nghiệm bằng que cấy • Cấy chuyền từ các ống giống thuần từ môi trường thạch:
- Cầm ống giống giữa ngón trỏ và ngón cái của bàn tay trái ở vị trí nằm ngang sao cho mặt môi trường có VSV mọc quay lên phía trên. Tay phải cầm que cấy, khử trùng que cấy trên ngọn đèn rồi để nguội gần ngọn đèn.
- Dùng ngón tay út hoặc ngón nhẫn của bàn tay phải mở nút của ống giống. Không được đặt nút ống nghiệm xuống bàn. Giữ miệng ống nghiệm gần ngọn đèn.
- Để que cấy nguội rồi lấy một vòng VSV từ ống giống thuần. Cấy VSV vào môi trường mới.
- Hơ miệng ống nghiệm và nút bông trên ngọn đèn. Nút ống nghiệm lại. Khử trùng lại que cấy trên ngọn đèn cồn.
• Cấy chuyền VSV trên môi trường dịch thể bằng pipep:
- Trộn đều dịch huyền phù VSV bằng máy trộn dung dịch hoặc lắc nhẹ bằng tay. Dùng pipet thủy tinh đã được vô trùng. Gắn đầu pipet vào chuôi của bộ phận điều chỉnh hút dịch.
- Dùng ngón tay út của bàn tay phải mở nút ống nghiệm chứa dịch huyền phù VSV. Hơ nhanh miệng ống nghiệm trên ngọn đèn vài lần để khử trùng.
- Dùng pipet hút dịch trong ống nghiệm, khử trùng lại ống nghiệm và nút bông trên ngọn đèn, nút ống nghiệm lại.
- Nhỏ 1 giọt dịch từ pipet lên mặt môi trường thạch trong đĩa Petri hoặc vào môi trường trong ống nghiệm. Bỏ pipet vào nơi khử trùng trước khi rửa. Mang đĩa Petri hoặc ống nghiệm vừa cấy chuyền VSV vào tủ ấm nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp [3].
c) Phương pháp khảo sát, theo dõi khả năng lan tơ của hệ sợi nấm trong các điều kiện khác nhau
Để xác định điều kiện môi trường thích hợp nhất cho việc bảo quản và nhân giống phù hợp cũng như đánh giá khả năng kháng khuẩn từ hệ sợi của loại nấm Linh chi, tiến hành thí nghiệm với các trường hợp sau:
- Hệ sợi nuôi cấy trong môi trường có pH thay đổi: pH = 4,5-6,5, môi trường PDA (Potato Dextro Agar), nuôi cấy 1 - 2 ngày trong tủ ấm sau đó theo dõi hệ sợi nấm ở nhiệt độ 35-37oC.
- Hệ sợi nuôi cấy trong môi trường có nhiệt độ thay đổi: 29oC, 33oC, 37oC, môi trường PDA (Potato Dextro Agar) pH =4,5-6,5
- Hệ sợi nuôi cấy trong môi trường thạch khác nhau: Môi trường PDA, Môi trường PGA,YMA,TH, với pH = 4,5-6,5, nuôi cấy 1 - 2 ngày trong tủ ấm sau đó theo dõi hệ sợi nấm ở nhiệt độ 29 - 33oC.
• Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với từng trường hợp.
Các chỉ tiêu theo dõi: Tốc độ lan tơ (đo đường kính hệ sợi), màu sắc và hình thái hệ sợi nấm (hệ tơ dày hay mỏng, có màu sắc gì).
• Cách tiến hành thí nghiệm:
- Các môi trường hấp khử trùng ở 121oC, tương đương 1 atm, trong thời gian 15 - 20 phút.
- Đổ môi trường vào đĩa Petri vô trùng, để nguội.
- Sau khi cấy 2 ngày, theo dõi đo đường kính của tơ nấm cho tới khi tơ lan hết đĩa. Kết hợp theo dõi, nhận xét hệ tơ và màu sắc
4.2.3. Phương pháp giữ giống
Giữ giống ở môi trường bẳng ống eppendorf
Grixeril
Môi trường cấy thạch nghiêng
Môi trường lỏng
Môi trường đông lạnh
- Sử dụng phương pháp , chụp ảnh , ghi lại số liệu- kích thước( đường kính)-nhiệt độ ( và pH phù hợp) để phân tích kết quả thu được trong bố trí thí nghiệm
MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA:
Hình 2.5. Sau khi hấp thanh trùng MT
Hình 2.7 Lắc đều kháng sinh ở nhiệt độ 45-50OC trước khi đổ môi trường ra đĩa petri
5. Môi trường nuôi cấy nấm 5.1. Môi trường PDA (cấp II) 5.1. Môi trường PDA (cấp II)
- Dịch chiết khoai tây: 750ml/l
- Thạch Agar: 20g/l
- Đường Dextrose: 20g/l
- Nước cất: 250 ml/l
- Khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) – 200g, thêm nước cho đủ 1 lít. Đun sôi đến chín kỹ khoai tây rồi lọc qua vải màn. Sau đó mới thêm dextrose – 20g, 20g thạch agar bổ sung nước cất cho đủ 1 lít rồi chuyển vào cốc 1000ml đun cho tan thạch. Phân vào các bình tam giác, đậy nút bông rồi hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1at trong 20 phút. Môi trường này không cần điều chỉnh pH. Sau khi khử trùng môi trường để nguội xuống khoảng 50oC tiến hành đổ vào đĩa Petri vô trùng khoảng 20ml rồi dùng tay xoay tròn cho môi trường dàn đều trong đĩa. Các đĩa sử dụng phải vô trùng mới mang đi cấy giống nấm. Tiếp tục cho thêm kháng sinh vào dung dịch (½ penicilin tương ứng 1 bình tam giác 250 ml)
- Đo pH 4,5 (5,0 – 5,5 – 6,0). Dùng NaOH để tăng pH dung dịch và H2SO4 để giảm pH dung dịch.
- Đổ dung dịch ra đĩa petri (đổ dung dịch ra đĩa petri trong tủ cấy, tủ cấy được khử trùng bằng cách bật đèn UV để khử trùng và lau bằng cồn.).
- Sau khi đổ môi trường vào đĩa petri, để các đĩa petri đã đổ môi trường vào trong tủ ấm để tránh nhiễm bẩn bởi các VSV bên ngoài. Đợi 1 ngày sau khi đổ môi trường để cấy nấm.
- Lựa chọn các mẫu nấm phát triển tốt, không nhiễm bẩn để cấy truyền vào các đĩa petri đã đổ môi trường (trước khi tiến hành cấy truyền tay phải sát trùng tay bằng cồn 70o, sát trùng mặt bàn làm việc trước và sau khi tiến hành).
Các bước cấy truyền: