4. ðố it ượ ng, phạm vi và ñị añ iểm nghiên cứ u
1.6.Biện pháp sinh học sử dụng vi sinh vật ñố i kháng trong công
thực vật
Vi sinh vật ựối kháng là những tác nhân kiểm soát sinh học như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, virus, tuyến trùng... làm giảm một số hoạt tắnh trong sản phẩm của
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ41
nguồn bệnh. Cùng với sự quan tâm nghiên cứu về nguồn lực tự nhiên ựang bị giảm sút như nước, không khắ, ựất và ô nhiễm môi trường, biện pháp sinh học bệnh cây ựã ựược nhấn mạnh. Tuy rằng kiểm soát sinh học bệnh cây diễn ra chậm, nhưng ựưa lại lợi ắch và là một quá trình lâu dài, không tốn kém, không gây hại cho cuộc sống con người. Hệ thống kiểm soát sinh học không tiêu diệt hết mầm bệnh, dịch bệnh mà ựem lại sự cân bằng trong tự nhiên. Biện pháp này ựã ựược sự quan tâm và ựầu tư rất lớn của nhiều phòng thắ nghiệm trên thế giới trong nhiều thập kỷ qua (Trigalet, 2002)[89].
Mặc dù biện pháp sinh học trên thế giới ựã thành công hơn 1000 năm, nhưng những nghiên cứu về biện pháp sinh học ở Việt Nam chỉ mới bắt ựầu từ những năm ựầu thập kỷ 70 của thế kỷ XX (Phạm Văn Lầm, 1995)[19]. Biện pháp ựấu tranh sinh học ngày càng ựược mở rộng và có vai trò chiến lược trong công tác bảo vệ thực vật (đái Duy Ban và cs, 1994)[1].
Ở nước ta trong hơn thập kỷ qua, việc nghiên cứu ứng dụng biện pháp sinh học cũng ựang ựược nhiều nhà khoa học, nhiều cơ quan xúc tiến mạnh mẽ. Xuất phát từ thực tế về bệnh héo rũ cây trồng ở Việt Nam, các biện pháp phòng trừ sinh học bệnh này ựã và ựang ựược sự quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng như nhiều phòng thắ nghiệm trong nước.
Kết quả ỘNghiên cứu công nghệ xản xuất phân bón VSV ựa chủng, phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh tháiỢ thuộc ựề tài khoa học cấp nhà nước KC.04.04 khẳng ựịnh phân VSV ựa chủng, ựa chức năng không chỉ có ý nghĩa như một loại phân bón làm gia tăng sinh khối và năng suất cây trồng (ngay cả khi giảm 10-30% phân bón vô cơ) mà còn có khả năng hạn chế một số bệnh vùng rễ cây trồng cạn do các chủng VSV gây ra như héo rũ do
Ralstonia sonalacearum và Fusarium oxysporum (Phạm Văn Toản, 2005)[34]. Các thắ nghiệm ựã nghiên cứu, lựa chọn và sản xuất chế phẩm phòng chống bệnh hại cây trồng có nguồn gốc từ vi sinh vật ựối kháng. Trường đại học Khoa học tự nhiên ựã nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ42
xanh của Streptomyces arabicuss 112 và chế phẩm sinh học Fluorecent từ
Pseudomonas fluorescens (Phạm Văn Ty và cs, 2003)[38].
Trường đại học Sư phạm I-Hà Nội ựã nghiên cứu chủng xạ khuẩn
Streptomyces V6 có khả năng sinh kháng sinh chống nấm và vi khuẩn Ralstonia solanacearum (Nguyễn Hoàng Chiến và cs, 2001)[6].
Viện Công nghệ Sinh học cũng ựã sản xuất các chế phẩm Bt và một số chế phẩm sinh học khác có nguồn gốc từ vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm v.v..Các chế phẩm này ựã có tác dụng trong phòng chống một số sâu và bệnh hại cây trồng.
Bộ môn Vi sinh vật-Viện Thổ nhưỡng Nông hóa ựã nghiên cứu tạo chế phẩm phân bón vi sinh trên cơ sở một tập hợp ựa chủng vi sinh vật, trong ựó có vi khuẩn ựối kháng, sản phẩm ựược sử dụng trong trồng trọt vừa có tác dụng kắch thắch sinh trưởng của cây, vừa có khả năng ức chế một số bệnh thực vật gây ra bởi vi khuẩn hoặc nấm (Nguyễn Thu Hà và cs, 2003; Vũ Thuý Nga và cs, 2002; Phạm Văn Toản, 2003)[14, 22, 32].
Viện Bảo vệ thực vật cũng ựã sử dụng một số chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nấm Trichoderma có khả năng ựối kháng với nấm gây bệnh cây trồng.
Mặc dù việc sử dụng biện pháp kiểm soát sinh học nguồn bệnh trong ựất còn hạn chế, nhưng kết quả của nó là bền vững và chắc chắn. Hiện nay, biện pháp sinh học ngày càng phát triển mạnh mẽ và ựược sử dụng như một biện pháp quan trọng, cốt lõi của phòng trừ tổng hợp dịch hại.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ43 CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguồn mẫu dùng trong nghiên cứu
Các mẫu bệnh phẩm dưa hấu héo rũ, mẫu ựất trồng dưa hấu và trồng rau màu thu thập từ một số tỉnh phắa Bắc như Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Hoà Bình, Hải DươngẦ
2.1.2. Vi sinh vật ựối kháng
Vi sinh vật ựối kháng bệnh héo rũ dưa hấu ựược phân lập từ ựất vùng rễ của cây dưa hấu và ựất trồng cây rau màu như cà chua, ớt, bầu bắ...
2.1.3. Giống dưa hấu
Các giống dưa hấu (VL-408; 227) sử dụng trong nghiên cứu ựảm bảo giống sạch bệnh do Công ty cổ phần Giống cây trồng Trung ương cung cấp.
2.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường sử dụng trong nghiên cứu bao gồm PDA, TWA, CLA, NA, SPA, TTC, Czapeck, KingẦ (Phụ lục 1)
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- điều tra mức ựộ nhiễm bệnh héo rũ và triệu chứng bệnh héo rũ trên dưa hấu. - Nghiên cứu xác ựịnh tác nhân gây bệnh héo rũ trên dưa hấu.
- Phân lập, tuyển chọn và ựánh giá hoạt tắnh sinh học của vi sinh vật ựối kháng. - Nghiên cứu xác ựịnh tên vi sinh vật ựối kháng.
- Nghiên cứu khả năng kiểm soát bệnh héo rũ dưa hấu của vi sinh vật ựối kháng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp ựiều tra mức ựộ gây hại của bệnh héo rũ cây dưa hấu
điều tra mức ựộ gây hại của bệnh héo rũ dưa hấu theo phương pháp ựiều tra của Cục Bảo vệ thực vật (1987) và đặng Vũ Thị Thanh (1997)[5, 25]. Trên diện tắch 400-500m2, tiến hành ựiều tra 5 ựiểm, mỗi ựiểm 100 cây, ựếm số cây bị héo và ghi triệu chứng chết cây. điều tra vào 2 thời kỳ chắnh:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ44 - Thời kỳ cây con: sau trồng 15-30 ngày.
- Thời kỳ ra hoa và hình thành quả: sau trồng 45-50 ngày. Tỉ lệ bệnh tắnh theo công thức:
TLB% = Số cây bị héo x 100 Tổng số cây ựiều tra
2.3.3. Phương pháp thu thập mẫu bệnh héo rũ.
Tiến hành thu mẫu bệnh tại một số xã thuộc các tỉnh như Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Hải Dương trên một số giống phổ biến và thời vụ khác nhau. Kết hợp thu mẫu bổ sung ở các giai ựoạn.
Thu thập tất cả các hiện tượng héo bắt gặp ựược, ựể mẫu riêng từng túi mang về phòng giám ựịnh nguyên nhân gây bệnh (đặng Vũ Thị Thanh, 1997)[25].
2.3.3. Phương pháp xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh
2.3.3.1. Phương pháp ựểẩm:
Rửa sạch mẫu bệnh:
- Rửa mẫu bệnh sạch ựất, cát, dưới vòi nước
- đặt mẫu bệnh vào hộp petri có giấy thấm vô trùng - Sau 1-2 ngày quan sát vi sinh vật gây bệnh từ mô bệnh
2.3.3.2. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ mẫu cây bệnh
* Phương pháp khử trùng mặt ngoài: Phương pháp này giúp loại bỏ các ký sinh gây bệnh có thể phát triển tốt khi ựặt trong ựiều kiện thắch hợp (Nguyễn Văn Tuất, 1997; Nguyễn Văn Tuất, 2002)[36, 37]. Các Bước tiến hành chi tiết ựược ghi trong phần phụ lục 2.
* Trong trường hợp vết bệnh nằm phắa trong bó mạch của cây bệnh, dùng dao ựã tiệt trùng qua lửa ựèn cồn ựể chẻ dọc thân bệnh theo chiều từ phần khỏe ựến phần bệnh, cẩn thận cắt miếng cấy (3-5 mm) tại ựiểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe. Dùng panh vô trùng gắp miếng cấy ựặt lên ựĩa Petri chứa môi trường agar - nước cất. đối với các thân cây nhỏ, có thể dùng dao vô trùng cắt miếng cấy ở phần
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ45
tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh, sau ựó khử trùng bề mặt (1-3 phút trong natri hypochlorite), rửa lại bằng nước vô trùng và cấy lên bề mặt môi trường.
2.3.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh
Phát hiện và phân lập vi khuẩn từ mô cây bệnh theo phương pháp của Nguyễn Văn Tuất (1997), Nguyễn Văn Tuất (2002)[36, 37]. Các Bước tiến hành chi tiết ựược ghi trong phần phụ lục 2.
2.3.4. Phương pháp lây bệnh nhân tạo ựể xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh
Dựa trên nguyên tắc Koch: Dùng dung dịch bào tử ựã ựược phân lập và nuôi cấy từ nguồn bệnh, nhiễm bệnh cho cây trồng trong nhà lưới. Nếu triệu chứng trên cây dưa hấu ựược lây bệnh nhân tạo tương tự như nguồn bệnh ựã ựược thu thập và phân lập vi sinh vật ựể lây bệnh thì ựược coi là nguyên nhân gây bệnh, tiến hành phân lập lại tác nhân gây bệnh.
Trường hợp nguồn bệnh là vi khuẩn, khả năng gây bệnh còn ựược xác ựịnh nhanh dựa trên sự xuất hiện màu hồng ở giữa khuẩn lạc mọc trên môi trường TTC và thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá.
Các bước lây bệnh nhân tạo:
- Chuẩn bị dung dịch bào tử bệnh ựể nhiễm: dịch bào tử ựể lây bệnh nhân tạo ựược lấy từ isolate ựã ựược phân lập và kiểm tra ựộ thuần, mật ựộ từ 108 CFU/ml
- Phương pháp gây sát thương rễ: Hạt dưa hấu ựược gieo trên ựất ựã khử trùng. Sau khi gieo 2 tuần dùng dao sắc rạch một ựường về một phắa sát rễ, sau ựó nhiễm 5ml dịch/cây vào rễ ựã sát thương. Quan sát triệu chứng cây bị bệnh từ 5-30 ngày sau nhiễm.
- Phương pháp nhiễm hạt ựã nẩy mầm: Ngâm hạt dưa hấu ựã nhú mầm vào dung dịch bào tử với nồng ựộ 108CFU/ml trong thời gian 15-20 phút. Gieo hạt ựã nhiễm vào trong khay ựất ựã ựược khử trùng. Giữ ựất ựủ ẩm ựể bệnh phát triển. Quan sát triệu chứng cây bị bệnh từ 15-45 ngày sau khi trồng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ46
- Xác ựịnh tên tác nhân gây bệnh dựa vào ựặc ựiểm hình thái tản nấm và bào tử (Dolly Carr, 1983; Keith Seifert, 1996; Nelson và cs, 1983)[57, 68, 73]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Xác ựịnh tên tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử. Các bước tiến hành như sau:
* Tách ADN cho phản ứng PCR
Cho 100 ộl ựệm lysis vào ống nhựa 1,5 ml. Lấy một vòng que cấy mẫu, trộn thật ựều bằng máy vortex hoặc nghiền bằng dụng cụ chuyên. đun hỗn hợp 100oC trong 15 phút. Thêm 100 ộl kaliaxetat, sau ựó trộn ựều và ựặt trên ựá 1 giờ. Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt ựộ 4oC, sau ựó lấy phần nổi phắa trên. Thêm 200 ộl CHCl3-Isoamyl alcohol và trộn ựều, ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút, sau ựó lấy phần nổi phắa trên. Làm lại như vậy thêm một lần nữa. Thêm 200 ộl 2- propanol (Iso-propanol) và ựặt trong ựá 20phút. Ly tâm 15.000 v/ph trong vòng 15 phút và lấy phần kết tủa. Rửa sạch phần tủa bằng etanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút và lấy tủa. Làm khô bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút. Hoà tan tủa trong TE (30-50 ộl), giữ trong tủ lạnh 4oC trong 1 ngày. Giữ ở -20oC trước khi sử dụng.
* Phản ứng PCR theo Sugita và Nakase
- Hỗn hợp phản ứng chi tiết trong phần phụ lục 3
- Mồi xuôi NL1: 5Ỗ- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG -3Ỗ - Mồi ngược NL4: 5Ỗ- GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3Ỗ
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Bước 1: 940C - 3 phút. Bước 2 (30 chu kỳ): 940C - 1 phút, 520C - 1phút 30 giây, 720C - 2phút 30 giây. Bước 3: 720C - 7 phút.
- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng ựiện di (phụ lục 3)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ47
Sử dụng bộ kit QIA của Invitrogen, đức (phụ lục 3). Mẫu ựược kiểm tra trên máy quang phổ khả kiến ở các bước sóng 260 và 280. Tắnh tỷ lệ tinh sạch: OD 260/OD280 > 1,7.
* Phản ứng khuếch ựại ADN cho sequencing
Các sản phẩm PCR tinh sạch ựược khuếch ựại với bộ kắt ABI PRISM Cycle sequencing và ựệm 5X sequence của Perkin-Elmer Applied Biosystem (phụ lục 3).
Mồi xuôi NL1: 5Ỗ- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG -3Ỗ Mồi ngược NL4: 5Ỗ- GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3Ỗ
Chu trình nhiệt khuếch ựại ADN cho sequencing
Bước 1: 960C - 1phút. Bước 2 (25 chu kỳ): 960C - 10 giây, 500C - 5 giây, 600C - 4phút.
Sản phẩm lúc này là các ựoạn ADN ựơn ựược duỗi ra. Tinh sạch sản phẩm cho sequencing (phụ lục 3)
* đọc trình tự ADN
Trình tự 26s rADN của chủng nấm ựược ựọc trực tiếp trên máy ựọc trình tự tự ựộng 3100 Avant. Sau ựó kết quả trình tự ựược so sánh với các trật tự của các loài ựã ựược xác ựịnh trong ngân hàng gen.
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật ựối kháng
-Thu thập mẫu và phân lập: Tiến hành thu thập mẫu ựất tại những nơi trồng dưa hấu, ựất trồng rau màu. Mẫu ựất ựược thu thập ở tầng canh tác 10-20cm, ựể trong túi giấy (có ghi nhãn ựịa ựiểm lấy mẫu, thời kỳ cây phát triển) sau ựó tiến hành phân lập vi sinh vật ựối kháng theo các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật của Nguyễn Lân Dũng (2005), Rupela và cs (2003)[12,85]
- Xác ựịnh hoạt tắnh ựối kháng của vi sinh vật theo 10TCN714-2005, 10TCN 876- 2006, Nguyễn Lân Dũng (2005) và Rupela và cs, (2003)[3,4,12,85].
- Xác ựịnh mật ựộ tế bào vi sinh vật ựối kháng bằng công thức:
N = ) 1 , 0 (n1 n2 d C + ∑
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ48 Trong ựó:
N: là số vi sinh vật trong một ựơn vị kiểm tra (CFU/g /ml);
∑C: là tổng số khuẩn lạc ựếm ựược trên tất cả các ựĩa Petri ựược giữ lại; n1: là sốựĩa ựược giữ lại ởựộ pha loãng thứ nhất;
n2: là sốựĩa ựược giữ lại ởựộ pha loãng thứ hai;
d : là hệ số pha loãng tương ứng với ựộ pha loãng thứ nhất.
2.3.7. Phương pháp thắ nghiệm khả năng ựối kháng của vi sinh vật ựối với tác nhân gây bệnh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.7.1. Thắ nghiệm ựánh giá khả năng kiểm soát bệnh héo rũ của vi sinh vật ựối kháng
đất trồng cây thắ nghiệm là loại ựất phù sa sông Hồng ựã ựược khử trùng ở 1,5at trong thời gian 1h ựến 1,5h ựể loại hết nấm và vi khuẩn. đất ựược ựựng trong các khay rổ (10kg ựất/khay rổ). Thắ nghiệm ựược trồng trong nhà lưới, bố trắ ngẫu nhiên, 5 lần nhắc lại, gieo 5-10 hạt/khay rổ. Thắ nghiệm tiến hành trong vụ Xuân và vụ Hè -Thu 2007.
Công thức thắ nghiệm:
Công thức 1: Không nhiễm vi sinh vật Công thức 2: Nhiễm nấm bệnh (đC) Công thức 3: Nhiễm vi khuẩn 5.1
Công thức 4: Nhiễm vi khuẩn 5.1 + nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Công thức 5: Nhiễm vi khuẩn M
Công thức 6: Nhiễm vi khuẩn M+ nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Công thức 7: Nhiễm vi khuẩn B17
Công thức 8: Nhiễm vi khuẩn B17+ nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Công thức 9: Nhiễm nấm Tri1
Công thức 10: Nhiễm nấm Tri1+ nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Công thức 11: Nhiễm nấm Tri2
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ49
Hạt dưa hấu ựược khử trùng bằng cồn 960 sau ựó cho nảy mầm. Ngâm hạt