4. ðố it ượ ng, phạm vi và ñị añ iểm nghiên cứ u
2.3.3.1. Phương pháp ñể ẩ m
Rửa sạch mẫu bệnh:
- Rửa mẫu bệnh sạch ựất, cát, dưới vòi nước
- đặt mẫu bệnh vào hộp petri có giấy thấm vô trùng - Sau 1-2 ngày quan sát vi sinh vật gây bệnh từ mô bệnh
2.3.3.2. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ mẫu cây bệnh
* Phương pháp khử trùng mặt ngoài: Phương pháp này giúp loại bỏ các ký sinh gây bệnh có thể phát triển tốt khi ựặt trong ựiều kiện thắch hợp (Nguyễn Văn Tuất, 1997; Nguyễn Văn Tuất, 2002)[36, 37]. Các Bước tiến hành chi tiết ựược ghi trong phần phụ lục 2.
* Trong trường hợp vết bệnh nằm phắa trong bó mạch của cây bệnh, dùng dao ựã tiệt trùng qua lửa ựèn cồn ựể chẻ dọc thân bệnh theo chiều từ phần khỏe ựến phần bệnh, cẩn thận cắt miếng cấy (3-5 mm) tại ựiểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe. Dùng panh vô trùng gắp miếng cấy ựặt lên ựĩa Petri chứa môi trường agar - nước cất. đối với các thân cây nhỏ, có thể dùng dao vô trùng cắt miếng cấy ở phần
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ45
tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh, sau ựó khử trùng bề mặt (1-3 phút trong natri hypochlorite), rửa lại bằng nước vô trùng và cấy lên bề mặt môi trường.
2.3.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh
Phát hiện và phân lập vi khuẩn từ mô cây bệnh theo phương pháp của Nguyễn Văn Tuất (1997), Nguyễn Văn Tuất (2002)[36, 37]. Các Bước tiến hành chi tiết ựược ghi trong phần phụ lục 2.
2.3.4. Phương pháp lây bệnh nhân tạo ựể xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh
Dựa trên nguyên tắc Koch: Dùng dung dịch bào tử ựã ựược phân lập và nuôi cấy từ nguồn bệnh, nhiễm bệnh cho cây trồng trong nhà lưới. Nếu triệu chứng trên cây dưa hấu ựược lây bệnh nhân tạo tương tự như nguồn bệnh ựã ựược thu thập và phân lập vi sinh vật ựể lây bệnh thì ựược coi là nguyên nhân gây bệnh, tiến hành phân lập lại tác nhân gây bệnh.
Trường hợp nguồn bệnh là vi khuẩn, khả năng gây bệnh còn ựược xác ựịnh nhanh dựa trên sự xuất hiện màu hồng ở giữa khuẩn lạc mọc trên môi trường TTC và thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá.
Các bước lây bệnh nhân tạo:
- Chuẩn bị dung dịch bào tử bệnh ựể nhiễm: dịch bào tử ựể lây bệnh nhân tạo ựược lấy từ isolate ựã ựược phân lập và kiểm tra ựộ thuần, mật ựộ từ 108 CFU/ml
- Phương pháp gây sát thương rễ: Hạt dưa hấu ựược gieo trên ựất ựã khử trùng. Sau khi gieo 2 tuần dùng dao sắc rạch một ựường về một phắa sát rễ, sau ựó nhiễm 5ml dịch/cây vào rễ ựã sát thương. Quan sát triệu chứng cây bị bệnh từ 5-30 ngày sau nhiễm.
- Phương pháp nhiễm hạt ựã nẩy mầm: Ngâm hạt dưa hấu ựã nhú mầm vào dung dịch bào tử với nồng ựộ 108CFU/ml trong thời gian 15-20 phút. Gieo hạt ựã nhiễm vào trong khay ựất ựã ựược khử trùng. Giữ ựất ựủ ẩm ựể bệnh phát triển. Quan sát triệu chứng cây bị bệnh từ 15-45 ngày sau khi trồng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ46
- Xác ựịnh tên tác nhân gây bệnh dựa vào ựặc ựiểm hình thái tản nấm và bào tử (Dolly Carr, 1983; Keith Seifert, 1996; Nelson và cs, 1983)[57, 68, 73].
- Xác ựịnh tên tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử. Các bước tiến hành như sau:
* Tách ADN cho phản ứng PCR
Cho 100 ộl ựệm lysis vào ống nhựa 1,5 ml. Lấy một vòng que cấy mẫu, trộn thật ựều bằng máy vortex hoặc nghiền bằng dụng cụ chuyên. đun hỗn hợp 100oC trong 15 phút. Thêm 100 ộl kaliaxetat, sau ựó trộn ựều và ựặt trên ựá 1 giờ. Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt ựộ 4oC, sau ựó lấy phần nổi phắa trên. Thêm 200 ộl CHCl3-Isoamyl alcohol và trộn ựều, ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút, sau ựó lấy phần nổi phắa trên. Làm lại như vậy thêm một lần nữa. Thêm 200 ộl 2- propanol (Iso-propanol) và ựặt trong ựá 20phút. Ly tâm 15.000 v/ph trong vòng 15 phút và lấy phần kết tủa. Rửa sạch phần tủa bằng etanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút và lấy tủa. Làm khô bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút. Hoà tan tủa trong TE (30-50 ộl), giữ trong tủ lạnh 4oC trong 1 ngày. Giữ ở -20oC trước khi sử dụng.
* Phản ứng PCR theo Sugita và Nakase
- Hỗn hợp phản ứng chi tiết trong phần phụ lục 3
- Mồi xuôi NL1: 5Ỗ- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG -3Ỗ - Mồi ngược NL4: 5Ỗ- GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3Ỗ
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Bước 1: 940C - 3 phút. Bước 2 (30 chu kỳ): 940C - 1 phút, 520C - 1phút 30 giây, 720C - 2phút 30 giây. Bước 3: 720C - 7 phút.
- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng ựiện di (phụ lục 3)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ47
Sử dụng bộ kit QIA của Invitrogen, đức (phụ lục 3). Mẫu ựược kiểm tra trên máy quang phổ khả kiến ở các bước sóng 260 và 280. Tắnh tỷ lệ tinh sạch: OD 260/OD280 > 1,7.
* Phản ứng khuếch ựại ADN cho sequencing
Các sản phẩm PCR tinh sạch ựược khuếch ựại với bộ kắt ABI PRISM Cycle sequencing và ựệm 5X sequence của Perkin-Elmer Applied Biosystem (phụ lục 3).
Mồi xuôi NL1: 5Ỗ- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG -3Ỗ Mồi ngược NL4: 5Ỗ- GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3Ỗ
Chu trình nhiệt khuếch ựại ADN cho sequencing
Bước 1: 960C - 1phút. Bước 2 (25 chu kỳ): 960C - 10 giây, 500C - 5 giây, 600C - 4phút.
Sản phẩm lúc này là các ựoạn ADN ựơn ựược duỗi ra. Tinh sạch sản phẩm cho sequencing (phụ lục 3)
* đọc trình tự ADN
Trình tự 26s rADN của chủng nấm ựược ựọc trực tiếp trên máy ựọc trình tự tự ựộng 3100 Avant. Sau ựó kết quả trình tự ựược so sánh với các trật tự của các loài ựã ựược xác ựịnh trong ngân hàng gen.
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật ựối kháng
-Thu thập mẫu và phân lập: Tiến hành thu thập mẫu ựất tại những nơi trồng dưa hấu, ựất trồng rau màu. Mẫu ựất ựược thu thập ở tầng canh tác 10-20cm, ựể trong túi giấy (có ghi nhãn ựịa ựiểm lấy mẫu, thời kỳ cây phát triển) sau ựó tiến hành phân lập vi sinh vật ựối kháng theo các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật của Nguyễn Lân Dũng (2005), Rupela và cs (2003)[12,85]
- Xác ựịnh hoạt tắnh ựối kháng của vi sinh vật theo 10TCN714-2005, 10TCN 876- 2006, Nguyễn Lân Dũng (2005) và Rupela và cs, (2003)[3,4,12,85].
- Xác ựịnh mật ựộ tế bào vi sinh vật ựối kháng bằng công thức:
N = ) 1 , 0 (n1 n2 d C + ∑
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ48 Trong ựó:
N: là số vi sinh vật trong một ựơn vị kiểm tra (CFU/g /ml);
∑C: là tổng số khuẩn lạc ựếm ựược trên tất cả các ựĩa Petri ựược giữ lại; n1: là sốựĩa ựược giữ lại ởựộ pha loãng thứ nhất;
n2: là sốựĩa ựược giữ lại ởựộ pha loãng thứ hai;
d : là hệ số pha loãng tương ứng với ựộ pha loãng thứ nhất.
2.3.7. Phương pháp thắ nghiệm khả năng ựối kháng của vi sinh vật ựối với tác nhân gây bệnh
2.3.7.1. Thắ nghiệm ựánh giá khả năng kiểm soát bệnh héo rũ của vi sinh vật ựối kháng
đất trồng cây thắ nghiệm là loại ựất phù sa sông Hồng ựã ựược khử trùng ở 1,5at trong thời gian 1h ựến 1,5h ựể loại hết nấm và vi khuẩn. đất ựược ựựng trong các khay rổ (10kg ựất/khay rổ). Thắ nghiệm ựược trồng trong nhà lưới, bố trắ ngẫu nhiên, 5 lần nhắc lại, gieo 5-10 hạt/khay rổ. Thắ nghiệm tiến hành trong vụ Xuân và vụ Hè -Thu 2007.
Công thức thắ nghiệm:
Công thức 1: Không nhiễm vi sinh vật Công thức 2: Nhiễm nấm bệnh (đC) Công thức 3: Nhiễm vi khuẩn 5.1
Công thức 4: Nhiễm vi khuẩn 5.1 + nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Công thức 5: Nhiễm vi khuẩn M
Công thức 6: Nhiễm vi khuẩn M+ nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Công thức 7: Nhiễm vi khuẩn B17
Công thức 8: Nhiễm vi khuẩn B17+ nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Công thức 9: Nhiễm nấm Tri1
Công thức 10: Nhiễm nấm Tri1+ nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Công thức 11: Nhiễm nấm Tri2
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ49
Hạt dưa hấu ựược khử trùng bằng cồn 960 sau ựó cho nảy mầm. Ngâm hạt ựã nảy mầm vào dịch vi sinh vật với nồng ựộ 108 CFU/ml/hạt trong thời gian 15-20 phút trước khi trồng.
Chỉ tiêu ựánh giá:
Tỷ lệ cây chết (%): Tắnh phần trăm cây chết (%) ở 45-50 ngày sau trồng
2.3.7.2. Thắ nghiệm ựánh giá ảnh hưởng của vi sinh vật ựối kháng ựến cây trồng và khả năng sống sót của chúng trong ựất
đất trồng và cách tiến hành thắ nghiệm ựược thực hiện như thắ nghiệm 2.3.7.1. Các chủng vi sinh vật lây nhiễm với nồng ựộ 108 CFU/g.
Công thức thắ nghiệm:
Công thức 1: đối chứng (không nhiễm vi sinh vật) Công thức 2: Nhiễm vi khuẩn 5.1
Công thức 3: Nhiễm vi khuẩn M Công thức 4: Nhiễm vi khuẩn B17 Công thức 5: Nhiễm nấm Tri1 Công thức 6: Nhiễm nấm Tri2
Các chỉ tiêu theo dõi: Do thắ nghiệm tiến hành trong nhà lưới trên nền ựất khử trùng, dinh dưỡng bị hạn chế nên thắ nghiệm chỉ xác ựịnh chỉ tiêu về số lá và khả năng tắch luỹ chất khô sau khi trồng 50 ngày.
- Số lá: xác ựịnh số lá trên thân chắnh.
- Khả năng tắch luỹ chất khô: sấy khô mẫu ở 1050C ựến khối lượng không ựổi. - Xác ựịnh khả năng sống sót của vi sinh vật trong ựất: phân tắch chỉ tiêu mật ựộ
tế bào của các vi sinh vật ựối kháng trước và sau khi nhiễm 15, 30, 50 ngày.
2.3.8. Phương pháp xác ựịnh tên vi sinh vật ựối kháng
Xác ựịnh tên vi sinh vật bằng phương pháp phân loại học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự ựoạn gen 16s ARN riboxom của các vi khuẩn, và 26s ADN riboxom của nấm nghiên cứu. So sánh với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gen quốc tế EMBL bằng phương pháp FASTA 33 ựểựịnh loại ựến loài các vi sinh vật. Trình tự
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ50
nucleotit của các VSV nghiên cứu ựược giải trình trên máy tự ựộng ABI-377 của Hãng Perkin-Elmer (Mỹ), sau ựó ựược xử lý bằng chương trình SeqEd1.03 và chương trình AssemblyLIGN 1.9 trong hệ chương trình MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.). Truy cập Ngân hàng Gen bằng chương trình Entrez/nucleotide/ tìm kiếm các trình tự gen 16s ARN riboxom của vi khuẩn và 26s ADN riboxom của nấm. So sánh ựối chiếu và xử lý số liệu của tất cả các chuỗi bằng chương trình GENDOC2.5. Thành phần nucleotit ựược thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp trong Ngân hàng Gen (bảng mã di truyền số 11) thông qua chương trình GENDOC 2.5. Tên vi sinh vật ựược xác ựịnh với xác suất tương ựồng cao nhất.
độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật sử dụng trong ựời sống có ý nghĩa ựặc biệt quan trọng. Theo hướng dẫn số 90/679/EWG ngày 26 thàng 11 năm 1990 của cộng ựồng Châu Âu về an toàn sinh học, nhóm tác nhân sinh học ựược phân làm 4 cấp ựộ an toàn, trong ựó chỉ các vi khuẩn ở cấp ựộ 1 và 2 ựược ứng dụng trong sản xuất ởựiều kiện bình thường.
- Cấp ựộ 1 (Risiko gruppe 1) là các vi khuẩn không có thể gây bất cứ một nguy hiểm nào ựối với người và ựộng vật
- Cấp ựộ 2 (Risiko gruppe 2) bao gồm các vi khuẩn có thể gây bệnh ựối với người, ựộng vật ở mức ựộ thấp, không có khả năng lan truyền và có thể phòng, chống và loại trừ dễ dàng trong ựiều kiện bình thường.
- Cấp ựộ 3 (Risiko gruppe 3) là các vi khuẩn có nguy cơ gây bệnh nặng ựối với người, ựộng vật và có khả năng lan truyền rộng, song vẫn có thể phòng chống và loại trừ ựược.
- Cấp ựộ 4 (Risiko gruppe 4) là các vi khuẩn có thể gây bệnh nặng ựối với người, ựộng vật, có nguy cơ lớn về mức ựộ lan truyền rộng và không thể phòng, chống hoặc loại trừ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ51
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả số liệu thắ nghiệm ựều ựược phân tắch, so sánh theo phương pháp thống kê sinh học của Phạm Chắ Thành (1988) [28] và chương trình phân tắch số liệu Excel, phần mềm IRRISTAT 4.0.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ52 CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. đIỀU TRA MỨC đỘ NHIỄM BỆNH HÉO RŨ VÀ TRIỆU CHỨNG BỆNH HÉO RŨ TRÊN DƯA HẤU
3.1.1. điều tra mức ựộ nhiễm bệnh héo rũ dưa hấu tại một số tỉnh phắa Bắc
Trong năm 2007, ựề tài tiến hành ựiều tra bệnh héo rũ dưa hấu tại các nơi thuộc một số tỉnh phắa Bắc có trồng nhiều dưa hấu như Hoà Bình, Vĩnh Phúc, Bắc Giang và Hải Dương. Bệnh héo rũ dưa hấu ựã ựược phát hiện ở hầu hết các vùng trồng dưa hấu như huyện Kim Bôi, Lạc Sơn, Yên Thuỷ, Lạc Thuỷ, Tân Lạc thuộc tỉnh Hoà Bình; huyện Yên Lạc, Vĩnh Tường, Tam đảo thuộc tỉnh Vĩnh Phúc; huyện Tân Yên, Yên Dũng thuộc tỉnh Bắc Giang và huyện Gia Lộc, Hải Dương.
Tại Hoà Bình dưa hấu ựược trồng phổ biến trong vụ Xuân từ tháng 2 ựến tháng 5 với các giống chủ yếu là dưa hấu lai nhập khẩu của Thái Lan, Trung Quốc, Hàn Quốc như Simenit 359, 668; Hưng Nông 1789, 1888, 1752, 148; Siêu nhân 150; Syngenta 24,29Ầ
Tại Vĩnh Phúc dưa hấu ựược trồng 2-3 vụ/năm, có nơi trồng 3 vụ liên tiếp như vụ Xuân, vụ Hè, vụ Thu (Yên Lạc); Vụ Xuân, vụ đông (Tam đảo) với các giống như An Tiêm, Syngenta 227, Syngenta TN 308, Hưng nông, Simenit.
Tại Bắc Giang dưa hấu ựược trồng nhiều trong vụ đông, vụ Xuân với các giống chủ yếu là dưa hấu hạt lai nhập từ Thái Lan (Syngenta 227, 229).
Tại huyện Gia Lộc, Hải Dương nông dân trồng dưa hấu Hè và dưa hấu vụ đông-Xuân. Giống dưa sử dụng chủ yếu là giống của công ty Giống Trang Nông, Nông Hữu, Hưng Nông.
Năm 2007 ựề tài ựiều tra trong vụ Xuân, vụ Hè-Thu. Tiến hành ựiều tra chủ yếu trong thời kỳ cây con, thời kỳ cây ra hoa và hình thành quả. Kết quả ựiều tra cho thấy sự gây hại của bệnh héo rũ dưa hấu rất khác nhau phụ thuộc vào ựiều kiện khắ hậu của từng nơi, tỉ lệ gây hại khác nhau ở các ựiều kiện khắ hậu khác nhau. Có
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ53
thể bắt gặp ở các ựịa ựiểm và thời ựiểu khác nhau cây dưa hấu chết hàng loạt, có khi cả ruộng thậm chắ cả cánh ựồng. Mức gây hại của bệnh trên hình 3.1.
Hình 3.1. Ruộng dưa hấu bị héo rũ tại Hoà Bình
Bệnh héo rũ dưa hấu phổ biến ở tất cả các ựịa phương trồng dưa hấu. Tỉ lệ