Nhiệt độ 240C 260C 280C 300C 320C 350C 370C T h ờ i g i a n 0h 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 4h 3,5±1,2 5,6±1,1 5,8±1,1 4,85±1,1 4,9±1,3 5,5±1,0 5±1,15 8h 12,5±1,1 15,4±1,0 16,5±1,1 12,5±1,0 11,5±1,0 10,0±1,1 9,5±1,1 12h 16,2±1,0 27±1,1 25,7±1,2 20±1,1 21,2±1,1 19,6±1,2 20,7±1,1 16h 75,5±1,1 95±1,0 95±1,0 80±1,1 93±1,1 85 ±1,1 70±1,0 20h 110,5±1,1 140±1,1 154±1,1 108±1,1 107±1,3 107±1,0 101,1 24h 140±1,1 155±1,1 162±1,3 145±1,0 145±1,1 140±1,1 130±1,3 28h 138±1,1 162±1,1 160±1,1 140±1,1 140±1,1 138±1,1 126±1,1
Từ kết quả cho thấy chủng nấm men TM4 sinh trưởng và phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 26-280C đạt trên 160 x 106tb/ml . Ở nhiệt độ trên 300C tốc độ sinh trưởng của chủng TM4 bị giảm không phù hợp quá trình sản xuất, điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Amerine.M.A, Bergh. W and Cruess.W khi nghiên cứu trên nấm men nói chung [12 ].
Vì vậy chúng tôi quyết định giữ nhiệt độ cho quá trình lên men của chủng
3.3.4 pH cho quá trình nhân giống
Chúng tôi tiến hành cấy chủng nấm men S.cerevisiae TM4 với số lượng tế bào ban đầu là (3,2 ± 1,1) x106tb/ml vào các môi trường của dịch nhân giống có độ pH ở các mức: 3; 3,3; 3,6; 3,8; 4,2; 4,5; 5,2; 7,2 (dùng axit HCl và NaOH để chỉnh pH) và nuôi cấy ở nhiệt độ 26-28oC. Chủng TM4 được nhân giống trong các bình tam giác 250 ml trên máy lắc ổn nhiệt trong khoảng thời gian 28 giờ. Chúng tôi thu được kết quả sau.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 SL tế bào 3 3.3 3.6 3.8 4.2 4.5 5.2 7.2pH sl te bao
Biểu đồ 3.3.4 Số lượng tế bào trung bình sau 28 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau
Chủng S.cerevisiae TM4 sinh sản và phát triển tốt trên môi trường nhân giống có độ pH 4,2-4,5. Rõ ràng chúng ta nhận thấy sau 28 giờ nuôi cấy số lượng tế bào nấm men đạt cực đại ở môi trường có pH 4,2-4,5. Chính vì vậy độ pH thích hợp là 3,8–4,5 bởi khi kiểm tra chất lượng tế bào nấm men tỉ lệ tế bào nẩy chồi là: 70-73%, hơn nữa độ pH này cũng phù hợp với pH của dịch quả. Ở các giá trị pH khác chủng nấm men TM4 sinh sản yếu ớt và khi pH môi trường cao dễ bị nhiễm khuẩn.
Vì vậy chúng tôi giữ mức pH thích hợp cho quá trình lên men của chủng
3.3.5 Hàm lượng oxy hoà tan trong quá trình nhân giống
Trong quá trình nhân giống, nấm men cần oxy để sinh trưởng. Vì vậy hàm lượng O2 có ảnh hưởng rất mạnh mẽ đến sự sinh sản của nấm men. Để nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố này tới sự sinh sản của chủng TM4 chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên máy lắc với tốc độ khác nhau. Ứng với mỗi tốc độ lắc là
một giá trị oxy hoà tan nhất định. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3.5 Bảng 3.3.5 Hàm lượng oxy hoà tan trong quá trình nhân giống
SLTB(x106tb/ml) Hàm lương O2(mg/l) 4-6 8 8,25 8,5 8,75 9 Tốc đô lắc(v/phút) Không lắc 100 130 150 170 200 Thời gian 0h 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 4h 3,3±1,0 3,4±1,2 3,6±1,3 3,8±1,3 4,0 ±1,0 4,6±1,1 8h 3,5±1,1 4,6±1,1 5,8±1,1 7,5±1,1 7,8±1,1 8,2±1,2 12h 4,8±1,2 5,5±1,0 10,0±1,1 16±1,3 21±1,1 21±1,0 16h 5,6±1,1 66±1,1 68,5±1,1 70±1,1 75±1,1 76±1,1 20h 9,15±1,0 99±1,1 91,2±1,4 88,5±1,3 98±1,0 102±1,1 24h 18,2±1,1 109±1,1 128±1,1 139±1,1 145±1,1 152±1,3 28h 78±1,1 122±1,0 135±1,1 140±1,1 151±1,1 170±1,1
Từ kết quả cho thấy chủng nấm men TM4 sinh sản mạnh khi hàm lượng O2 hoà tan trong khoảng 8 - 9 mg/l. Ở mẫu đối chứng (không lắc) chủng TM4 sinh sản yếu ớt, môi trường bị nhiễm khuẩn. Như vậy việc bổ sung O2 trong quá trình nhân giống là hoàn toàn hợp lý. Kết quả này cũng phù hợp với các công bố của các tác giả Amerine.M.A, Bergh. W and Cruess.W Amerine.M.A, Bergh. W and Cruess.W. khi nghiên cứu trên nấm men nói chung [12], [13].
3.4. Nghiên cứu di truyền phân tử của nấm men
Việc nghiên cứu cấu trúc di truyền ở cấp độ phân tử cho phép ta xấc định chính xác tên khoa học của các chủng loài vi sinh. Cơ sở sinh học của phương pháp này là: Những chủng loài có họ hàng với nhau sẽ có trình tự DNA giống nhau. Việc giải trình tự DNA và so sánh tìm độ sai khác sẽ cho phép ta định
loại và xác định vị trí của chủng nấm men trong cây phát sinh chủng loài. Đã có nhiều công trình giải mã di truyền bộ gen vi sinh vật. Nhưng chủ yếu trên đối tượng vi khuẩn. Chưa có công trình nghiên cứu nào về bộ gen của nấm men. Bằng những phương pháp và kĩ thuật tách chiết vi sinh vật, chúng tôi mạnh dạn áp dụng để tiến hành giải mã bộ gen của chủng nấm men phân lập từ quả táo mèo. Bước đầu là tiến hành tách chiết DNA tổng số.
Quy trình giải mã bộ gen nấm men 1. Nuôi cấy nấm men để thu sinh khối 2. Tách DNA tổng số
3. Điện di để tách gen 4. Nhân gen bằng PCR 5. Đọc trình tự gen
3.4.1. Nuôi cấy nấm men trên môi trường YDP: - 1% (w/v) cao men
- 2% (w/v) pepton - 2% (w/v) dextrose
3.4.2. Tách DNA tổng số: Tiến hành theo thứ tự các bước sau:
- Bước 1: Nuôi cấy tế bào nấm men trong môi trường YDP, nhiệt độ 30oC
- Bước 2: Hút dịch nuôi cấy sang ống thuỷ tinh nhỏ, ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 12000vòng/ phút trong vòng 2 phút, thu lấy cặn tế bào và thêm vào 5ml nước cất để hoà tan cặn.
- Bước 3: Ly tâm tế bào với tốc độ 12000vòng /phút trong vòng 5 phút và loại bỏ phần nổi, hoà tan cặn trong 500 µl của Lysis Buffer và lắc mạnh, thêm 0,3g hạt thuỷ tinh có đường kính 2mm và lắc mạnh khoảng 30 giây, thêm 25 µl dịch NaCl 5M và lắc mạnh khoảng 30 giây.
- Bước 4: Ly tâm trong siêu ly tâm với tốc độ cao nhất trong vòng 2 phút.
- Bước 5: Di chuyển phần nổi cả cặn sang ống ly tâm sạch
- Bước 6: Thêm 400 µl phenol lắc đều rồi lại ly tâm với tốc độ cao nhất trong vòng 5 phút, tách thành từng pha, pha cao hơn là pha nước.
- Bước 7: Giữ pha nước và thêm vào 1 lượng phenol: chloroform, tiếp tục ly tâm với tốc độ cao nhất trong vòng 5 phút, chiết phenol: loroform giữ pha nước.
- Bước 8: Thêm vào 1ml của 95% Ethanol, lắc đều rồi lại ly tâm với tốc độ cao nhất trong vòng 10 phút và loại bỏ đi phần nổi.
- Bước 9: Rửa lai bằng 1ml Ethanol, lắc đều rồi lại ly tâm với tốc độ cao nhất trong vòng 6 phút và loại đi phần nổi.
- Bước 10: Giữ cặn DNA trong 50 µl nước cất, bảo quản ngắn ở 4oC, bảo quản dài ở - 20oC.
3.4.3. Điên di trên gel agarose - thu DNA genom - Bước 1: Đổ gel agarose 1%.
Cân 1 lượng agarose 1% cho vào bình tam giác có chứa 20ml dung dịch đệm TAE, khuấy đều ngâm khoảng 15 phút. Đun cách thuỷ dung dịch gel, lắc nhẹ để hoà tan các hạt agarose, đun nóng chảy hoàn toàn, để nguội khoảng 50-60oC thì đổ gel, trước khi đổ bổ sung 1,5µl thuốc nhuộm Et brom. Đổ gel vào khuôn đã được lắp đặt sẵn, cắm lược vào sao cho lược ngập trong gel khoảng 1,5mm, đợi cho gel nguội đông cứng ta chuyển gel sang bồn điện di. Đổ đệm gập gel khoảng 3-5mm, dùng pipet hút rửa giếng gel.
Dùng pipet 10µl hút 3µl dung dịch DNA trộn đều với 2µl dung dịch đệm 6x Sucarose , dùng pipet 10µl nạp mẫu vào giếng gel thao tác phải chính xác để tránh mất mẫu.
- Bước 3: Chạy điện di.
Sau khi nạp gel xong nối dòng điện dẫn vào bồn với nguồn, tiến hành chạy điện di ở 50V trong vòng 60 phút.
- Bước 4: Xử lý gel sau khi điện di.
Sau khi chạy điện di gel được lấy ra và soi bằng tia uv, dưới ánh sáng uv ta thấy các giải băng sáng phát huỳnh quang có màu vàng cam. Ta quan sát được nhiều giải huỳnh quang có kích thước khác nhau bao gồm: các phân đoạn DNA genom có cùng phân tử gam, các phân tử RNA và các DNA bị đứt gãy. Sau đó tiến hành thu DNA genom từ gel. Để thu DNA genom ta tiến hành cắt các đoạn gel chứa DNA genom rồi ngâm vào dung dịch đệm thích hợp, DNA sẽ khuyếch tán từ gel ra dung dịch đệm. Sau đó tiến hành tinh sạch DNA dùng để chạy PCR. 3.4.4. Nhân gen bằng PCR và đọc trình tự gen còn đang chờ kết quả
* Kết quả và kết luận
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết và thu được DNA genom của nấm men chủng TM4 phân lập từ dịch táo mèo (Hình 3.3). Trên đây là những nghiên
cứu bước đầu để thu DNA tổng số sử dụng cho các bước tiếp theo trong quy trình giải trình tự của đoạn DNA quy định RNA-18S
Hình 3.3Ảnh chụp gel sau điện di soi trên tia uv