2380 Bô ̣t cà rốt Glucose,
2.3.4. Môi trường nuôi cấy với cơ chất là rơm, rạ
2.3.4.1. Quy trình xử lý rơm, rạ
Bước 1: Xử lý cơ học: Rơm rạ được cắt nhỏ từ 5-10 cm, sau đó nghiền nát và lọc qua lưới sàng kích thước 1mm.
Bước 2: Xử lý hóa học:
- Tiền xử lý với NH3: Rơm được xử lý bằng NH3 10%. Sau đó, phần chất rắn được thu hồi và rửa sạch bằng nước.
- Tiền xử lý với H2SO4: Phần rắn sau khi đã được xử lý bằng NH3 10% sẽ được xử lý tiếp với H2SO4 1%.
31
2.3.4.2. Phương pháp xác định thành phần rơm, rạ (Nguyen và cs, 2008)
Dùng acid sulfuric 72% 24N để hydro hóa và hòa tan các cacbohydrat trong gỗ; lignin không hòa tan trong axit được lọc và cân
- Cách pha hóa chất:
Axit sulfuric 72% 24N, trọng lượng riêng 1.6338 được chuẩn bị như sau: Rót 665ml acid sulfuric đậm đặc vào 300ml nước, làm lạnh pha thành 1000 ml, điều chỉnh nồng độ thành 24N bằng cách chuẩn độ với kiềm. Hỗn hợp ethanol-benzen: 1 thể tích ethanol 95% và 2 thể tích benzene.
- Cách tiến hành:
Lấy 2g bột rơm, cho 25 ml hỗn hợp ethanol - benzen vào, để yên trong 30 phút, gạn bỏ hỗn hợp trên, cho thêm 25ml ethanol dể trong 15 phút, gạn bỏ ethanol, rửa lại bằng nước nóng, lọc để loại nước. Bột rơm được sấy khô trong tủ sấy 60ºC. Cân lấy 1g bột rơm đã loại resin cho vào bình 250ml, cho từ từ 15ml H2SO4 72% vào, dùng đũa khuấy thật kĩ giữ mẫu ở 2ºC cho đến khi tan mẫu. Sau khi mẫu tan, bao miệng bình lại và giữ ở nhiệt độ thường trong hai giờ. Thường xuyên khuấy cho đến khi mẫu trong bình tan thành dịch. Cho khoảng 300 - 400ml nước vào bình 1000ml và chuyển mẫu từ bình 250ml vào, rửa và pha loãng tới thể tích 575ml (độ H2SO4 khoảng 3%). Lắp ống sinh hàn ngược (hồi lưu) và đun trong 4 giờ kể từ lúc sôi. Để yên cho lắng tủa, hút bỏ phần dịch nổi, rửa axit lẫn trong lignin với nước nóng, làm khô lignin bằng cách sấy ở 105ºC đến trọng lượng không đổi, đặt trong bình hút ẩm và cân.
- Cách tính kết quả:
Kết quả tính ra hàm lượng lignin trong 1g mẫu.
Công thức tính: hàm lượng lignin = x 100 (%)
Trong đó: A = trọng lượng của lignin (g) W = trọng lượng khô của mẫu (g)
A W
32
Đo hàm lượng cellulose sau khi phân hủy lignin: (Nguyen và cs, 2008)
- Cân 1-2 g mẫu đã sấy khô, cho vào bình cầu dung tích 500ml. Thêm vào 200 ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp ống sinh hàn ngược (hồi lưu và đun nhẹ trong 30 phút (không để bọt trào lên). Kĩ thuật này dùng để hòa tan tinh bột, các pectin, lignin có tính chất acid và ít kết hợp với cellulose, không ảnh hưởng đến hàm lượng cellulose ngay cả những phân tử thấp nhất.
- Lọc qua giấy lọc, rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH nóng, cho cặn cellulose tác dụng với 10ml dung dịch HCl 10% trong bình cầu ở nhiệt độ thường. Thêm 10ml dung dịch nước javen từng giọt một, vừa cho vừa khuấy đều, để yên trong 5 phút rồi lọc. Cho cặn tác dụng với dung dịch NaOH 0.5% ở nhiệt độ 40ºC để hòa tan lignin (đã bị clo hóa), để yên vài phút rồi lọc. Lặp lại hai lần nữa để có cellulose thật trắng. Rửa kĩ bằng nước sôi, sấy khô đến trọng lượng không đổi, đặt trong bình hút ẩm và cân.
Kết quả tính ra hàm lượng cellulose (%) trong 1g mẫu.
Công thức tính: Hàm lượng cellulose = x 100 (%)
Trong đó: A = trọng lượng của cellulose (g) W = trọng lượng khô của mẫu (g)
Quy trình để xác định thành phần carbonhydrate: Đầu tiên, rơm được thủy phân bởi acid sulfuric 72% (w/w) ở 30 °C trong 60 phút, sau đó thủy phân tiếp bằng acid sulfuric 4% (w/w) ở 121°C trong 60 phút (được thực hiện trong lò hấp).Sau đó, thành phần đường được phân tích bằng hệ thống HPLC.