Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất đơn giản

2380 Bô ̣t cà rốt Glucose,

2.3.1. Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất đơn giản

Danh mục hóa chất, xuất xứ

Glycerol: Trung quốc Pepton: Merck Glucose: Merck Xylose: Merck KH2PO4: Merck Na2HPO4.12H2O: Merck FeSO4.7H2O: Merck ZnSO4.7H2O: Merck CuSO4.5H2O: Merck

Kal (SO4)2.12H2O: Merck H3BO3: Merck

Na2MoO4.2H2O : Merck NiCl2.6H2O : Merck Na2SeO3.5H2O: Merck Cao nấm men: Merck Reazurin: Sigma

CysteinHCl.H2O : Sigma Và một số hóa chất thông dụng khác.

Trong nghiên cứu này, môi trường nuôi cấy được chuẩn bị cho phương pháp lên men theo mẻ (batch fermentation) dưới điều kiện kị khí [21].

- Các bước pha môi trường và thành phần của môi trường bao gồm: • Dung dịch gốc 1: KH2PO4: 1.5 g/l

29 • Dung dịch gốc 2: MgCl2.6H2O: 0.2 g/l • Dung dịch gốc 2: MgCl2.6H2O: 0.2 g/l

• Tiền môi trường (1 lít): 100 ml dung dịch gốc 1 100 ml dung dịch gốc 2

200μl reazurin (1.0mg/l) 15 ml TES

• Môi trường: 1 lít tiền môi trường Cao nấm men: 2g/l

NaCl: 20g/l

Nguồn carbon (glucose, xylose, glycerol): 5g/l CysteinHCl.H2O: 1.1g/l

• Trong đó, TES (trace elements solution) bao gồm các thành phần sau: Nitrilotriacetic acid : 1.5 g/l MgSO4.7H2O : 3.0 g/l MnSO4.2H2O : 0.5 g/l NaCl : 1.0 g/l FeSO4.7H2O : 0.1 g/l CoSO4.7H2O : 0.18 g/l CaCl2.2H2O : 0.1 g/l ZnSO4.7H2O : 0.18 g/l CuSO4.5H2O : 0.01 g/l KAl (SO4)2.12H2O : 0.02 g/l H3BO3: 0.01 g/l Na2MoO4.2H2O : 0.01 g/l NiCl2.6H2O : 0.025 g/l Na2SeO3.5H2O : 0.3 mg/l

- Cách pha TES (Trace element solution): Khi pha TES, ta phải hòa tan Nitrilotriacetic acid trước vào 500ml nước cất và điều chỉnh pH về 6.5 bằng KOH vì Nitrilotriacetic acid là một acid rất khó để hòa tan. Sau đó thêm các chất khoáng còn lại và nước cất cho đến 1000ml và điều chỉnh pH cuối cùng của TES là 7.0 bằng KOH.

- Khi môi trường đã được pha xong thì pH của môi trường được điều chỉnh về 7.5 bằng NaOH.

- Mỗi 15ml môi trường sẽ được cho vào bình serum 30ml sau đó được đóng nắp cao su và nắp nhôm bên ngoài.

- Headspace của bình serum được sục khí N2 tinh khiết trong khoảng 5 phút để loại bỏ hết O2 trong bình nhằm tạo môi trường kị khí.

30

- Khi môi trường nuôi cấy trong bình serum trở nên trong suốt và lắc lên không thấy có hiện tượng chuyển sang màu hồng thì môi trường đó đã sẵn sàng để cấy giống.

- Cấy giống từ 5-10% (v/v) khi vẫn đang tiến hành sục khí N2.

- Cuối cùng cho bình serum đã cấy vào bể lắc ổn nhiệt và nuôi cấy ở 75oC, 100 rpm.