c. Cơ cấu đất
2.6.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli)
Ngày nay, khi cuộc sống con người ngày càng được nâng cao thì điều mà họ quan tâm là vệ sinh ăn uống. Hằng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khỏe của cộng đồng. Điều này không chỉ phổ biến ở Việt Nam mà ngay cả các nước khác trên thế giới cũng vậy. E. coli là một trong những nguyên nhân gây nên những bệnh nhiễm khuẩn nghiêm trọng.
+ Sơ lược về E. coli
E. coli là trực khuẩn hình que ngắn, gram âm bắt màu hồng, kích thước dài hay ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, trung bình 2 - 3μm x 0,5μm, hai đầu tròn, có lông quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động không hình thành nha bào. Trong bệnh phẩm có khi bắt màu lưỡng cực hai đầu.
E. coli còn có tên gọi là Bacteriam coli commue được ông Escherich phát hiện năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em.
Theo P.J.Quinn (1994), E. coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn tạp hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nước, ngoài tự nhiên. Hầu hết chúng không gây hại cho người và động vật, giúp ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên cho đến nay đã phát hiện được 5 dòng có khả năng gây hại cho người và động vật là:
EAEC (Enteroaggregative E. coli), E. coli kết tạp ở ruột.
EHEC (Enterohemorrhagic E. coli), E. coli gây xuất huyết ở ruột. EPEC (Enteropacthogenic E. coli), E. coli gây bệnh đường ruột. ETEC (Enterotoxigenic E. coli), E. coli sinh độc tố ruột.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 18 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
+ Đặc điểm, cơ chế gây bệnh và các triệu chứng..
Đặc điểm: Chúng tiết ra các độc tố tế bào, các dòng vi khuẩn này có một plasmid có thể giúp chúng bám dính vào màng nhầy của ruột, gây tiêu chảy không có hoặc có máu và các hội chứng khác ở người.
Cơ chế gây bệnh: Để gây bệnh trước hết vi khuẩn phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các nhân tố xâm nhập, vi khuẩn bám dính vào lớp tế bào biểu mô của thành ruột. Ở đây, chúng phát triển và nhân lên làm phá hủy các lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột. Đồng thời sinh sản độc tố đường ruột enterotoxin gồm yếu tố chịu nhiệt làm tăng tính thấm xuất của tế bào thành ruột và phá hủy tế bào, yếu tố không chịu nhiệt sẽ tác động vào quá trình trao đổi muối, nước làm rối loạn chu trình này. Nước từ cơ thể chảy vào ống ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác động cơ học làm nhu động ruột đẩy nước và thức ăn gây nên hiện tượng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột, chúng vào hệ bạch huyết, đến hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu, chúng nhanh chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ thống tuần hoàn chúng theo các vi quản đến các tổ chức, cơ quan, ở đây chúng lại phát triển nhân lên lần thứ hai. Chúng phá hủy tế bào tổ chức gây viêm và sản sinh độc tố toxogenic và verotocin phá hủy tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết.
Triệu chứng: Sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm E. coli thì trong vòng 24 – 48h sẽ có các triệu chứng như đau bụng, đi ngoài phân lỏng từ 5 – 15 lần/ngày có lẫn máu
Hình 5: Vi khuẩn Escherichia coli
Chuyên ngành Vi sinh vật học 19 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
trong phân, đôi khi có buồn nôn, Nếu không được cấp cứu, xử trí kịp thời sẽ bị mất nước, điện giải, rối loạn thân nhiệt, hạ huyết áp và có thể tử vong.
2.6.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A .hydrophila)
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng đất giàu tiềm năng được thiên nhiên ưu đãi có lợi thế rất lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản.. Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL đã có những bước phát triển vượt bật mang lại hiệu quả kinh tế cao, đặc biệt cá tra là đối tượng nuôi chiến lược, thu lại nguồn ngoại tệ rất lớn. Tuy nhiên, do sự gia tăng quá mức của phong trào nuôi cá tra trong khi kỹ thuật của người nuôi chủ yế dựa vào kinh nghiệm. Mặt khác do sự phát triển tự phát thiếu qui hoạch, mật độ thả nuôi và quản lý dịch bệnh còn hạn chế nên dịch bệnh thường xuyên xảy ra gây thiệt hại cho người nuôi.
Cá tra, cá basa và nhiều loại cá nước ngọt khác, dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến, các tác nhân gây bệnh cho cá gồm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi trường, dinh dưỡng. Bên cạnh đó, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila cũng là một loại bệnh phổ biến, xuất hiện hầu như quanh năm trên cá tra và cá basa nuôi bè.
(Nguồn:http://aquanetviet.org/post/142037/ng-d-ng-qui-tr-nh-pcr-th-i-gian-th-t-ph-t-hi-n-vi-khu-n-aeromon, ngày 10/1/2013)
Chuyên ngành Vi sinh vật học 20 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bệnh xuất huyết gọi là bệnh đốm đỏ, có dấu hiệu bệnh lý bên ngoài là xuất huyết trên gốc các vi và xoang miệng. Bên trong thấy xuất huyết ở cơ, ruột, mô mỡ, kèm theo những dấu hiệu khác như trương bụng hay lỡ loét ở gốc vi đuôi và vi hậu môn (Phan Văn Ninh et al., 1993). Bệnh xuất huyết gây tổn thất cho người nuôi về sản lượng và chất lượng sản phẩm khi xuất bán.
+ Sơ lược về A. hydrophila
Vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, Aeromonas là vi khuẩn Gram âm, di động, hình que, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử nitrate, có khả năng lên men, oxidase dương tính.
+ Trong giống Aeromonas có hai nhóm:
Nhóm 1: Aeromonas không di động (A. salmonicida) thường gây bệnh ở nước lạnh.
Nhóm 2: Là các loài Aeromonas di động, bao gồm A. hydrophyla, A. caviae, A. sobria. Đặc tính chung của ba loài vi khuẩn này là di động nhờ có 1 tiên mao. Vi khuẩn Gram âm dạng hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,5 x 1,0-1,5 àm. Vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện, Cytochrom oxidase dương tính, khử nitrate, không mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129... Tỷ lệ Guanin + Cytozin trong ADN là 57 - 63 mol%.
Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu hay bệnh sởi…..Nguyên nhân của bệnh là do vi khuẩn A. hydrophila gây ra (Bergey, 1957)
Hình 7: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila.
(Nguồn: http://tepbac.com/disease/full/31/Benh-nhiem-trung-do-vi-khuan-Aeromonas-di-dong-o-dong-vat-thuy- san.htm, Ngày 16-11-2013)
Chuyên ngành Vi sinh vật học 21 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
+ Một số nghiên cứu về A. hydrophila
Groberg (1978) khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi giống đã kết luận tỷ lệ chết thường cao ở 20,5°C và 17°C, tỷ lệ chết thấp hơn ở 15°C và 12°C, còn ở 9°C hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không chết (Roselynn and Stevenson, 1988).
Theo báo cáo của Rahman et al., (2000) thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila
trên cá vàng (Carassius auratus) bằng 4 cách: tiêm ở bụng (mật độ vi khuẩn 3x104- 3x108 CFU/ml), tiêm dưới da (8,5x104-8,5x108 CFU/ml), tiêm ở cơ (8x104-8x108 CFU/ml), và ngâm vi khuẩn (4,6x104-4,6x108 CFU/ml), sau khi so sánh kết quả gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới da độc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD50 là 106,4 CFU/ml.
Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) đã thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng A. hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 103 đến 107 CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có giá trị LD50 lần lược là 3,68x106 CFU/ml, 2,64x106 đến 4,52x106 CFU/ml và 1,96x106 đến 1,45x107 CFU/ml
2.7 Tình hình nghiên cứu Sài đất trong và ngoài nƣớc
2.7.1 Trong nước
Đến nay, Việt nam đã có nhiều công trình nghiên cứu cây dược liệu nhưng phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây dược liệu đặc biệt là Sài đất thông qua các nghiên cứu điều trị lâm sàng. Khi canh tác cây dược liệu đa phần sử dụng phân bón hóa học hay phân bón hữu cơ. Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây dược liệu có khả kích thích cây phát tiển tốt thông qua khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp hormone tăng trưởng kích thích cây dược liệu phát triển, góp phần giảm các loại bệnh, giảm chi phí sản xuất và đặc biệt là khả năng tổng hợp các hoạt chất kháng khuẩn của chúng khi sống nội sinh với cây chưa được quan tâm nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 22 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
2.7.2 Ngoài nước
Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong cây dược liệu, đặc biệt là những cây dược liệu nhiệt đới như: cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.), cây Sài đất (Wedelia chinensis M.), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)…
Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các chủng E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi và Klebsiella pneumonia (Swetha Sunkar, C Valli Nachiyar, 2012)
Bacillus polymyxa nội sinh trên cây Arabidopsis thaliana có khả năng tổng hợp kháng sinh polymyxin kháng lại cả nấm và vi khuẩn (Salme Timmusk et al., 2005).
Artidtaya Bhoonobtong et al., (2012) khi nghiên cứu trên cây Phyllodium pulchellum, vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sống nội sinh có khả năng diệt E. coli, Pseudomonas aeruginosa.
Theo nghiên cứu của Sheng Qin et al.,(2009). Đã phân lập được một số dòng vi khuẩn nội sinh như: Streptomyces specialis trong rễ cây Sedum sp., Pseudomonas alni
trong lá cây Hoa môi (Callicarpa longifolia) cũng có khả năng kháng khuẩn.
Theo nghiên cứu của Sameksha Koul et al., (2012). Dịch trích ethanol của cây Sài đất (Wedelia chinensis) có khả năng bảo vệ và phục hồi chức năng gan, chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, giảm đau, làm dịu, chống căng thẳng, ngăn ngừa loãng xương,…
Theo Merina Paul Das et al., (2013). Dịch trích ethanol trong lá cây Sài đất (Wedelia chinensis) có tác dụng kháng khuẩn đáng kể với bốn vi khuẩn gram dương (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus) và bốn vi khuẩn gram âm (Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli). Xét nghiệm kháng nấm cũng đã được thực hiện chống lại bốn loại nấm (Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Candida albicans, Alternaria alternata),… và tất cả các thử nghiệm trên đều cho kết quả tốt…
Chuyên ngành Vi sinh vật học 23 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG III
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian – Địa điểm thực hiện
Thời gian: từ tháng 7 – 12 / 2013
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật – Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học
3.1.2 Dụng cụ - thiết bị
- Đĩa petri, ống nghiệm - Ống trữ mẫu
- Cốc thủy tinh 10ml, 100ml, 200ml - Micropipet – Biorad (Mỹ)
- Kẹp, kim cấy, que trải mẫu, đèn cồn - Lame, Lammelle – Duhan group (Đức) - Máy Vortex
- Tủ cấy vi sinh vật Biosafe II – Esco (Singapore) - Tủ ủ vi sinh vật Binder (Đức)
- Máy đo OD – Beckman Coulter DU 640B (Đức) - Bộ điện di
- Cân điện tử – Startorius (Đức)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt – Pbinternational (Đức) - Máy lắc mẫu – GFL 3005 (Đức)
- Kính hiển vi – Meji (Nhật)
- Trắc vi thị kính – Olympus (Nhật) - pH kế - Hanna (Mỹ)
Chuyên ngành Vi sinh vật học 24 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Hình 11: Máy lắc Hình 10: pH kế Hình 9: Tủ ủ Vi sinh vật Hình 13: Trắc vi thị kính Hình 8: Tủ cấy Vi sinh vật Hình 12: Kính hiển vi (Hình chụp, ngày 18-11-2013)
Chuyên ngành Vi sinh vật học 25 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
3.1.3 Vật liệu
- Toàn bộ rễ, thân và lá của cây Sài đất tại tỉnh Vĩnh Long.
- Chủng vi khuẩn E. coli được cung cấp từ PTN Sinh học phân tử - Viện NC&PT CNSH.
- Chủng vi khuẩn A. hydrophila được cung cấp từ bộ môn Bệnh học thủy sản – Khoa Thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.4 Hóa chất
a. Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh
Bảng 1: Môi trƣờng PDA. Hóa chất Liều lƣợng (g/l) Khoai tây 200 Dextrose 20 Agar 20 pH 5,6 ± 0,2
Thêm vừa đủ 1000ml nước cất
b. Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân
Bảng 2: Môi trƣờng NBRIP đặc (Nautiyal, 1999).
Hóa chất Liều lƣợng (g/l) Glucose 10 MgSO4.7H2O 0,25 Ca3(PO4)2 5 MgCl2.6H2O 5 KCl 0,2 (NH4)2SO4 0,1
Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 3ml
Agar 20
Chuyên ngành Vi sinh vật học 26 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
c. Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4+
Bảng 3: Môi trƣờng NFb (g/l) (Kirchhof và ctv, 1997). Hóa chất Liều lƣợng (g/l) Acid malic 5 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,1 CaCl2 0,02 KOH 4,5 Dung dịch vi lượng 2ml Dung dịch Vitamine 1ml Dung dịch FeEDTA 1,64% 4ml
Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 2ml
pH 6,8
Ghi chú: đối với môi trường bán đặc, bổ sung thêm 2g agar.
Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lƣợng Hóa chất Liều lƣợng (g/l) Na2MoO4.2H2O 1 MnSO4.H2O 1,5 H2BO3 1,4 CuSO4 0,4 ZnSO4.7H2O 0,12
Chuyên ngành Vi sinh vật học 27 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamin
Hóa chất Liều lƣợng (mg/l)
Biotin 10
Pyridyoxyl - HCl 20
Thêm nước cất vào cho đủ 100ml
d. Môi trường khảo sát khả năng kháng khuẩn
Bảng 6: Môi trƣờng LB (Lauria Betan)
Hóa chất Liều lƣợng (g/l) Tryptone 10,0 Yeast extract 5,0 NaCl 10,0 Agar 20 pH 7,2
e. Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn
- Crystal violet, iod - Fushin, ethanol 70% - Nước cất f. Hóa chất trích DNA - Ethanol 70% - Eppendorf 1,5ml và 2,0 ml - Micropipet - Tăm tre nhọn - Môi trường LB
Chuyên ngành Vi sinh vật học 28 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học g. Hóa chất thực hiện phản ứng PCR - Hóa chất 2 lần đã khử trùng. - Eppendorf 0.2ml - PCR buffer - dNTPs ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP) - Taq polymerase - DNA vi khuẩn
- Để nhận diện vi khuẩn nội sinh sống trong cây, sử dụng các đoạn mồi 16SrRNA (Lane,1991) được thiết kế với trình tự sau:
27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ - Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng). (Bảng 7) Bảng 7: Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Thể tích (μl) Nước cất hai lần 11,75 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 Mồi xuôi 27F 0,25 Mồi ngược 1492R 0,25 dNTPs 4,0
Taq polymerase 5U/µl 0,25
DMSO ADN vi khuẩn
0,5 2,0
Chuyên ngành Vi sinh vật học 29 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh
pH của đất vùng rễ đo được là 7,2. Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá.
Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm rồi làm khô chúng bằng giấy hút ẩm.
Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch ethanol 70% (trong 30 giây), dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng.
Lấy nước rửa lần thứ 4 cấy lên môi trường PDA để xem có vi khuẩn xuất hiện hay không. Nếu có khuẩn lạc phát triển thì cần phải khử trùng triệt để hơn để loại bỏ vi sinh vật có trong đất.
Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem nghiền mịn trong cối cùng với 1ml nước cất vô trùng.
Lấy 10µL dung dịch nghiền ở trên cấy vào ống nghiệm chứa môi trường Nfb bán đặc không bổ sung đạm rồi đem ủ ở 30°C để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
Sau khoảng 2 - 3 ngày nuôi, khi thấy môi trường nuôi vi khuẩn xuất hiện một lớp màng mỏng trắng đục (pellicle) cách mặt môi trường bán đặc khoảng 2 - 6mm, lấy 5µl dung dịch nuôi vùng này cấy sang đĩa petri chứa môi trường PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 30°C trong tủ ủ để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập đến khi vi