- Crystal violet, iod - Fushin, ethanol 70% - Nước cất f. Hĩa chất trích DNA - Ethanol 70% - Eppendorf 1,5ml và 2,0 ml - Micropipet - Tăm tre nhọn - Mơi trường LB
Chuyên ngành Vi sinh vật học 28 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học g. Hĩa chất thực hiện phản ứng PCR - Hĩa chất 2 lần đã khử trùng. - Eppendorf 0.2ml - PCR buffer - dNTPs ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP) - Taq polymerase - DNA vi khuẩn
- Để nhận diện vi khuẩn nội sinh sống trong cây, sử dụng các đoạn mồi 16SrRNA (Lane,1991) được thiết kế với trình tự sau:
27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ - Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng). (Bảng 7) Bảng 7: Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Thể tích (μl) Nước cất hai lần 11,75 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 Mồi xuơi 27F 0,25 Mồi ngược 1492R 0,25 dNTPs 4,0
Taq polymerase 5U/µl 0,25
DMSO ADN vi khuẩn
0,5 2,0
Chuyên ngành Vi sinh vật học 29 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh
pH của đất vùng rễ đo được là 7,2. Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá.
Sau đĩ cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm rồi làm khơ chúng bằng giấy hút ẩm.
Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch ethanol 70% (trong 30 giây), dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 4 lần bằng nước cất vơ trùng.
Lấy nước rửa lần thứ 4 cấy lên mơi trường PDA để xem cĩ vi khuẩn xuất hiện hay khơng. Nếu cĩ khuẩn lạc phát triển thì cần phải khử trùng triệt để hơn để loại bỏ vi sinh vật cĩ trong đất.
Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem nghiền mịn trong cối cùng với 1ml nước cất vơ trùng.
Lấy 10µL dung dịch nghiền ở trên cấy vào ống nghiệm chứa mơi trường Nfb bán đặc khơng bổ sung đạm rồi đem ủ ở 30°C để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
Sau khoảng 2 - 3 ngày nuơi, khi thấy mơi trường nuơi vi khuẩn xuất hiện một lớp màng mỏng trắng đục (pellicle) cách mặt mơi trường bán đặc khoảng 2 - 6mm, lấy 5µl dung dịch nuơi vùng này cấy sang đĩa petri chứa mơi trường PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 30°C trong tủ ủ để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập đến khi vi khuẩn rịng.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 30 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
3.2.2 Quan sát hình dạng, kích thước và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách rịng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
Tiến hành chụp hình vi khuẩn nội sinh dưới kính hiển vi điện tử quét JBS 5500 (Nhật) ở độ phĩng đại 20.000 lần để thấy rõ hơn hình dạng tế bào, các chiên mao ở đầu và chiên mao bên của vi khuẩn.
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
- Nhỏ 10μL nước cất vơ trùng lên kính mang vật.
- Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trãải đều lên giọt nước trên kính mang vật.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 gĩc 45° rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật khơng cĩ bọt khí.
Để đo kích thước vi khuẩn ta dùng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính như sau:
- Thước trắc vi thị kính là một miếng kính trịn trên đĩ chia thành 100 vạch, nĩ được đặt giữa hai thấu kính của thị kính.
- Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng cĩ độ dài 10µm.
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn như sau:
- Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ ảnh của thước.
- Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho hai thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 31 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
- Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. - Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo cơng thức sau:
m n
N x 10
x: Trị số 1 khoảng cách của thước trắc vi thị kính N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N = 6 n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n = 35
m x 10 35 6 Ta cĩ:
- Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu.
- Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đĩ tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
- Đếm số khoảng cách thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
- Tính kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của hai thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh
Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, ta tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
- Lấy 10μL nước cất vơ trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 32 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
- Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật cĩ chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vơ trùng, chậm nhẹ cho khơ nước.
- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vơ trùng, chậm nhẹ cho khơ.
- Rửa lại bằng cồn 70° thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng khơng cịn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vơ trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khơ.
- Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đĩ để 1 phút. - Rửa lại bằng nước cất vơ trùng cho đến giọt nước cuối cùng khơng cịn màu
của fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khơ nước.
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn cĩ màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram dương, cĩ màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm.
3.2.4 Xác định khả năng tổng hợp NH4+
a. Nguyên tắc
Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hĩa là hypochlorite hình thành cĩ phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982)
b. Hĩa chất
- Chuẩn bị dung dịch KCl2 M: Hịa tan 15 g KCl vào trong 100 ml nước cất.
- Stock (NH4+): Hịa tan 0,4717g (NH4)4SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha lỗng 40ml stock (NH4+) để được 200ml, sau cùng được dung dịch 2µg/ml
Chuyên ngành Vi sinh vật học 33 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
- Thuốc thử phenol nitroprusside: hịa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong nước được 0,5L.
- Hypochlorite buffer: hịa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5L. - Chuẩn bị các dịng vi khuẩn đã tách rịng và mơi trường NFb lỏng
c. Tiến hành thí nghiệm:
- Cho 15ml mơi trường lỏng NFb vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuơi cấy các dịng vi khuẩn trên máy lắc 200 vịng/phút.
d. Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6, 8 (sau khi chủng)
- Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hịa tan thêm nước cất vào đến 0,5L.
- Pha buffer: cho 1ml NaOCl cĩ nồng độ (5 – 5,25 %) và 5 g NaOH vào 0,5L nước cất.
- Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm
+ Đường chuẩn 0 ppm gồm cĩ: 5ml H2O, 0ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đường chuẩn 1 ppm gồm cĩ: 4ml H2O, 1ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đường chuẩn 2 ppm gồm cĩ: 3ml H2O, 2ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đường chuẩn 3 ppm gồm cĩ: 2ml H2O, 3ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đường chuẩn 4 ppm gồm cĩ: 1ml H2O, 4ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đường chuẩn 5 ppm gồm cĩ: 0ml H2O, 5ml NH4+, 5ml buffer, 5 ml thuốc thử - Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
+ Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. + Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 10 phút.
+ Hút 1ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 34 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
+ Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bước sĩng 636nm, sau đĩ vẽ đồ thị trên Excel cĩ thể tính được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.
- Mỗi mẫu đo được lặp lại 3 lần, sau đĩ tính giá trị trung bình của 3 lần đo sau ngày 2, ngày 4, ngày 6 và ngày 8, kết quả thu được như trong Phụ lục 1.
3.2.5 Xác định khả năng hịa tan lân
- Chuẩn bị mơi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) (Bảng 1)
- Hút 5µl vi khuẩn nhỏ lên bề mặt mơi trường.
- Ủ 30°C trong 12h – 24h.
- Quan sát khả năng tạo vịng halo. Đo đường kính halo và khuẩn lạc mỗi ngày
- Hiệu quả hịa tan lân E được tính theo cơng thức
100 lạc khuẩn kính Đường halo kính Đường E (C. NGUYEN et al., 1992) 3.2.6 Xác định khả năng tổng hợp IAA a. Chuẩn bị
- Chuẩn bị các dịng vi khuẩn đã tách rịng và mơi trường NFb lỏng.
- Cho 15 ml mơi trường lỏng NFb vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuơi cấy các dịng vi khuẩn trên máy lắc 200 vịng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng).
b. Hĩa chất
- Thuốc thử: 4,5g FeCl3 trong 1lit dd H2SO4 - Buffer
+ Dung dịch A2: 0,136g KH2SO4 trong 100ml nước cất + Dung dịch B2: 0,174g K2HSO4 trong 100ml nước cất
Chuyên ngành Vi sinh vật học 35 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
c. Phương pháp
- Lấy 39ml dung dịch A2, 61ml dung dịch B2 cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH = 7
- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. - Ly tâm 5.500 vịng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham.
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hồn tồn sau đĩ đo quang phổ OD ở bước sĩng 530nm.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: Cân 0,0016g IAA thương mại hịa tan với 10ml phosphat buffer được nồng độ là 160µg/l. Sau đĩ pha lỗng ra các nồng độ 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80µg/ml.
- Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD cĩ giá trị từ 0 – 3. Trục hồnh là nồng độ IAA cĩ giá trị từ 0 – 40µg/ml.
- Mỗi mẫu đo được lặp lại 3 lần, sau đĩ tính giá trị trung bình của 3 lần đo sau ngày 2, ngày 4, ngày 6 và ngày 8, kết quả thu được như trong phụ lục 6.
- Kết quả đo OD các dịng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đĩ tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp.
3.2.7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn
- Chuẩn bị mơi trường LB đặc.
- Trải vi khuẩn gây bệnh E. coli và A. hydrophila lên bề mặt đĩa mơi trường.
- Dùng giấy thấm đường kính 6 mm nhúng vào dung dịch vi khuẩn (mật số 108), đặt giấy thấm lên bề mặt mơi trường đã trải vi khuẩn E. coli và A. hydrophila
- Ủ 30°C trong 12h – 24h.
- Quan sát khả năng tạo vịng kháng khuẩn.
- Đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vịng sáng lần lượt qua 3 ngày liên tiếp. - Tính đường kính vịng vơ khuẩn theo cơng thức:
Đường kính vịng vơ khuẩn = Đường kính vịng sáng – Đường kính khuẩn lạc. (Ngơ Thị Phương Dung et al., 2011)
Chuyên ngành Vi sinh vật học 36 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
3.2.8 Nhận diện một số dịng vi khuẩn nội sinh tiêu biểu
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dịng vi khuẩn cĩ khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn cao nhất để thực hiện phương pháp PCR.
Quy trình trích ADN nhanh theo phương pháp của Barberio và Fani (1998).
- Cấy vi khuẩn từ ống trữ rịng lên đĩa petri chứa mơi trường LB. Ủ 24h trong tủ ủ ở 30°C.
- Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf
- Cho bi vào từng tuýp Eppendorf và trộn đều dung dịch trên máy ly tâm. - Ủ ở 95°C trong 10 phút (ủ trong water bath).
- Lập tức đem ngâm đá nhanh trong 10 phút để phá vỡ tế bào của vi khuẩn - Ly tâm nhẹ hai lần. Thu được dịch trích ADN của vi khuẩn.
- Đem trữ ở -20°C nếu chưa tiến hành quy trình PCR.
Nhận diện các dịng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
- Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng) (Bảng 5).
Quy trình PCR
- Biến tính DNA ở 95°C trong 5 phút.
- Tiếp theo là 3 chu trình được gia nhiệt như sau: + 95°C trong 1 phút
+ 49°C trong 1 phút + 72°C trong 1 phút
- Bước cuối cùng là 72°C trong 10 phút.
- Sản phẩm PCR sau đĩ được trữ lạnh ở -20°C để tiến hành điện di - Điện di gel agarose sản phẩm PCR
- Sản phẩm DNA sau khi trích, được tiến hành khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sau đĩ kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% cĩ chứa
Chuyên ngành Vi sinh vật học 37 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
ethidium bromide. Sản phẩm gel sau khi điện di được chụp bằng máy chụp hình gel Bio – Rad UV 2000 (Hoa Kỳ)
- Chuẩn bị gel nhỏ : (20ml) + Agarose (1%): 0,2g + TAE buffer (1X): 20ml
- Nấu 2 phút cho tan Agarose trong lị vi sĩng (microwave) - Sau khi nấu để nguội khoảng 50 – 60°C, bổ sung EtBr 0,4μl