3.1. Phân lâp flavonoid.
Chüng tôi tién hành phân lâp flavonoid bàng SKC vôi chât nhôi côt là cephadex LH20, dung môi pha dông là methanol 80%.
Chuân bi côt: Côt sâc kÿ duoc rüa sach, sây khô, lot mot lôp bông mông
à dây côt roi lâp lên giâ inox.
Ngâm cephadex trong methanol 80%, dë lâng, gan bô lôp dung môi phfa trên. Sau dô thêm MeOH 80% và khuây dêu thành hôn dich dông nhât roi cho lên côt. Gô nhe, dêu xung quanh thành côt tü duôi lên dë câc phân tü
chât nhôi xép khft nhau. Tiép tue cho dung môi chây liên tue qua côt trong khoâng 8 giô dé 6 n dinh côt.
Mâu phân tich là flavonoid toàn phàn duoc hoà tan vôi mot luçmg tôi thiëu MeOH 80%. Dùng pipet cô ong hüt cao su dua mâu lên côt. Sau dô rua giâi côt bàng MeOH 80%, vôi toc dô 10 giot/phüt.
Hûng câc phân doan vào ong nghiêm sach cô dânh sô, môi phân doan khoâng 2 ml. Câc phân doan duoc bay hoi câch thuÿ dén côn khoâng 0,5 ml. Kiëm tra câc thành phân trong tùng phân doan bàng SKLM vôi hê dung môi EtOAc: CH3COOH: H20 (20: 3: 4). Gôp câc phân doan cô thành phân giông nhau. Két quâ cho thây:
+ Tù phân doan 19-25 ( phân doan I ) trên sâc kÿ dô cô 2 vêt chât cô màu sàc và R f tuong ùng vôi vêt sô 3, 4 (trong bâng 4) trên SKLM.
+ Tù phân doan 50-60 ( phân doan II) trên sâc kÿ dô cô 2 vêt chât cô màu sâc và giâ tri R f tuong tmg vôi vét sô 4 và sô 5 trên sâc kÿ dô cüa SKLM (bâng 4). Gôp câc phân doan này roi dem cô câch thüy cho bay bôt dung môi, chüng tôi thu duçfc tüa màu vàng. Tâch riêng tüa và tai két tinh lai nhiêu lân bàng MeOH 50% thu duoc mot chât tinh khiét ( kÿ hiêu là N3 ). N3 chmh là chât tuong üng vôi vêt sô 4 trong bâng 3, hînh 11.
+ Tù phân doan 61 - 6 8 ( phân doan 3 ) trên sâc kÿ dô SKLM chî cô mot vêt chât. Gôp câc phân doan lai, cô câch thüy hét dung môi roi làm khô trong bînh km vôi chât hüt âm là silicagel. Thu duoc mot chât tinh khiét ( kÿ hiêu N2 ). N2 chfnh là chât tuong üng vôi vêt sô 5 trong bâng 4, hînh 1 1 .
3.2. Thir dô tinh khiét cüa N2 và N3:
Bàng SKG hai chiêu trong 2 hê dung môi kinh diên: Acid acetic: Nuôc ( 15: 85 ) và
n-Butanol: Acid acetic: Nuôc ( 4:1:5 )
Trên sac kÿ dô cüa N2 thây mot vét chât cô huÿnh quang màu nâu duôi ânh sang tü ngoai ( X = 366 nm ) và chuyën sang vàng rô rêt khi cho tâc dung vôi
hoi amoniac ( hinh 6 ); khi cho tâc dung vôi A1C13 3%, vét chât cô màu vàng à
ânh sâng thuông ( hïnh 5 ).
Cüng tuong tu: Sâc kÿ dô cüa N3 cho mot vét chât cô huÿnh quang màu vàng duôi ânh sâng UV( X = 366 nm ) khi tâc dung vôi hoi amoniac ( hïnh 7 )
Trên SKLM vôi 2 hê dung môi khai triën khâc nhau. N2 và N3 cüng dêu cho mot vét trên sàc kÿ dô ( bâng 5, hïnh 1 0 , 1 1 ). Diêu dô chüng tô N2 và N3
dêu là don chât tinh khiét.
Bâng 5: Két quâ SKLM cüa N2 , N3 trong 2 hê dung môi khâc nhau Chât thü
R f x 100 trong câc hê dung môi
Hê 5 Hê 8
N2 41,1 55,9
n3 30,5 33,7
3.3. Phân tich và nhân dang chât N2 và N33.3.1. Chat N2: 3.3.1. Chat N2:
Chât N2 thu duoc duôi dang bôt màu vàng nhat, tan tôt trong methanol, ethanol, trong nuôc nông, không tan trong ether ethylic. Cho màu vàng vôi dung dich NaOH 10% và màu hông vôi phân üng cyanidin, màu xanh den vôi dung dich FeCl3 5%.
Pho tü ngoai ( hïnh 16 ): Duoc do trong methanol, cô eue dai hâp thu à
bâng II: X = 256,667 nm và X = 347,778 nm. Dây là nhüng dînh hâp thu eue dai dàc trung cüa câc flavon.
Pho hông ngoai ( hïnh 17 ): Duoc do duôi dang viên nên KBr, cho câc bàng hâp thu eue dai dâc trung cüa câc nhôm chüc:
OH-Phenol (3448,8 cm '1), Carbonyl (C = 0) cüa vông y-pyron ( 1607,9 cm' 1 ) và bâng hâp thu cüa hop chât nhân thom (1490,4 cm' 1 ).
Dira vào nhùng két quâ phân tich vê tmh chât lÿ hoc và hoâ hoc trên dây, N2 cô thë là mot flavonoid glycosid.
3.3.2. Chât N3
N3 là châ't két tinh màu vàng nhat ( hinh 8 ), dë tan trong methanol, ethanol và nuôc nông, không tan trong ether ethylic.
Dung dich N3 trong côn cho màu vàng khi tâc dung vôi dung dich NaOH 10%; màu dô khi tâc dung vôi Mg và HC1 dâc; màu xanh den khi cho tâc dung vôi dung dich FeCl 5%.
Pho tir ngoai ( hïnh 20 ): Duoc do trong methanol cho hai dinh hâ'p phu eue dai à XmdK = 256,667 nm và À.max = 348,889 nm dâc trung cho câc flavon.
Pho hông ngoai ( hinh 21 ): Duoc do à dang viên nén KBr cho thâ'y câc eue dai hâ'p phu dâc trung cho câc nhôm chüc: OH-phenol ( 3387,8 cm' 1 ), nhôm carbonyl cüa vông y-pyron (1654,6 cm' 1 ) và câc bàng hâ'p phu cüa hop châ't tham (1607,3 cm '1, 1503 cm' 1 và 1456 cm '1).
Tü nhü'ng két quâ phân tich trên dây, chüng tôi cô thë du kiê'n N3 là mot dân châ't flavonoid thuôc nhôm flavon và là mot flavonoid glycosid.
3.3.3. Thuÿ phân, xâc dinh aglycon và dirông liên két
Dë tiê'p tue nghiên cüu vê câu trüc hoâ hoc cüa câc châ't này, chüng tôi dâ tiê'n hành thüy phân, xâc dinh phân aglycon và phân duông liên kêt.
Thüy phân châ't N2 và N3: Châ't N2 và N3 dêu duçfc tiê'n hành thuÿ phân bàng phuong phâp giông nhau.Cu thë: hoà tan châ't thü vào dung dich HC1 5% trong nuôc, dun câch thûy soi trong 5 giô. Sau dô dë nguôi, dich thûy phân dem làc vôi ether ethylic dë chiêt phân aglycon, nuôc côn lai sau khi lac vôi ether ethylic duoc trung hoà bàng baricarbonat dên pH trung tmh. Loc, dich loc bô'c hai câch thüy dên khô, hoà tan cân bàng côn 70° dë châ'm sac kÿ xâc dinh duông liên kêt.
+ Xâc dinh aglycon cüa N2 ( AN2 ): Hoà tan cân thu duoc sau khi bay hai hê't ether bàng côn 90° dë làm câc phân üng và châ'm sac kÿ.
Djnh tmh aglycon bàng câc phân üng ( nhu mue: 2, phàn 3-A ). Két quâ cho thây mâu thir duong tmh vôi tât câ nhüng phân üng hoâ hoc dàc trung cüa flavonoid.
Dinh tmh aglycon bàng SKG và SKLM:
Chüng tôi sü dung hê dung môi cho SKLM là EtOAc: CH3COOH: H20 (20: 3: 4), và hê CH3COOH: H20 ( 60: 40 ) cho SKG. Mâu thü duoc châm so sânh vôi câc mâu chuân là: apigenin, luteolin và N2. Két quâ cho thây dich chiét thü chî cho mot vêt chât cô màu sàc và giâ tri R f tuong üng vôi luteolin chuân ( hinh 1 2 ).
Két quâ trên dây chüng tô chât N2 dâ duoc thüy phân hoàn toàn và phân aglycon cüa N2 ( AN2 ) cô thë là luteolin ( 5, 7, 3 , 4 - tetrahydroxy flavon ).
Phân tich AN2 bàng pho khôi: Pho khôi duoc do theo kÿ thuât El - MS cho thây ion phân tü [ M ]+ üng vôi Pic 286 m/z, phân tü luong M = 286 tuong üng vôi công thüc C1 5H1 0O6. Câc Pic khâc thë hiên cho su phân mânh cüa AN2
khi bi phâ vô. Doi chiêu vôi ngân hàng dü liêu pho khôi cho thây N2 phù hop vôi pho khôi cüa luteolin ( chmh xâc 91% ). Do dô chüng tôi nhân dang phàn aglycon cüa N2là luteolin ( hinh 19 ).
Xâc dinh duông liên két: Dë xâc dinh duông liên két chüng tôi sü dung SKG môt chiêu vôi hê dung môi khai triën là n-butanol: acid acetic: nuôc ( 4 : 1 : 5 ). Phân duông cüa N2 duoc châm song song vôi duông chuàn: D-glucose. Câc vêt chât duoc hiên màu bàng dung dich anilin phtalat. Két quâ cho thây phàn duông cüa N2 cô 1 vét
chât cô R f và màu sàc tuong üng vét glucose chuân. So bô két luân phân
1 : Phân diràng cua N2
duông cüa N2 ît nhât cô D-glucose. 2; D _ glucose
+ Xâc dinh aglycon cüa N3 ( AN3 ): Hoà tan cân thu duoc sau khi bay hoi hét ether ethylic bàng con 90° de làm câc phân ûng và châ'm sàc kÿ.
AN3 duong tfnh vôi câc phân lîng hoâ hoc dac trung cüa flavonoid. Dinh tmh AN3 bàng SKLM: Hê dung môi khai triën là
EtOAc: CH3COOH: H20 ( 20:3:4 ). Két quâ cho thây giâ tri R f cüa N3 và AN3
là khâc nhau ( hinhl2 ). Diêu dô chüng tô N2 là mot glycosid. Mât khâc R f và màu sàc cüa AN3 tuong tu vôi luteolin chuân. So bô két luân AN3 cô thë là luteolin.