3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu
Mẫu dùng phân lập vi khuẩn là dịch ở khớp gối hoặc dịch ở gan bàn chân. Những mẫu này được thu thập khi mổ khám những con gà có biểu hiện viêm khớp để kiểm tra bệnh tích đại thể. Dùng tăm bông vô trùng thu lấy dịch ở khớp gối cho vào ống Carry Blair, trữ lạnh ở 4-80C và vận chuyển về phòng xét nghiệm để phân lập vi khuẩn ngay. Trên các mẫu này ghi lại ngày, tháng lấy mẫu, địa điểm, loại bệnh phẩm, giống và lứa tuổi của gà mắc bệnh. 3.4.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn
Quy trình phân lập S. aureus được thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 3.1 Quy trình định tính Staphylococcus aureus
(TCVN 4830-1:2005) Mẫu (tămpon)
Ria lên thạch BPA, ủ ở 370C/24 giờ
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang NA, ủ 370C/24 giờ Khẳng định Staphylococcus aureus Thử nghiệm Oxydase (-) Catalase (+) Đông huyết tương (+) Dung huyết (+)
24
Quy trình phân lập E. coli được thực hiện theo qua sơ đồ sau:
Hình 3.2 Quy trình định tính Escherichia coli
(TCVN 7924-1:2008) Các phản ứng sinh hóa
Phản ứng dung huyết
Dùng que cấy vô trùng cấy sinh khối vi khuẩn đã được làm thuần lên môi trường Blood Agar, đem ủ trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả
Staphylococcus aureus làm dung huyết trên môi trường thạch máu. Phản ứng đông huyết tương
Dùng que cấy vô trùng cấy vi khuẩn đã làm thuần vào trong ống eppendorf chứa 1,5 ml huyết tương thỏ, trộn đều, ủ ở 370C sau 4 - 24 giờ đọc kết quả.
Phản ứng dương tính: khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức
độ đông kết đều được xem là dương tính). Đó là Staphylococcus aureus.
Phản ứng âm tính: khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng
nhất như ống không cấy. Đó là Staphylococcus spp. khác.
Phản ứng Catalase
Lấy khuẩn lạc từ môi trường NA phết vào phiến kính rồi nhỏ dung dịch H2O2 3%. Đọc kết quả: phản ứng dương tính khi có hiện tượng sủi bọt trên phiến kính. Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt trên phiến kính.
Phản ứng Oxydase
Lấy khuẩn lạc từ môi trường NA cho vào đĩa thuốc thử Oxydase có nhỏ sẵn dung dịch nước muối sinh lý 9‰. Đọc kết quả: phản ứng dương tính khi môi
Mẫu (tămpon)
Ria lên thạch EMB, ủ ở 370C/24 giờ
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang NA, ủ 370C/24 giờ
Khẳng định E. coli
Thử nghiệm IMViC
MR (+)
25
trường chuyển sang màu tím đen. Phản ứng âm tính khi không làm đổi màu môi trường.
Phản ứng sinh hóa IMViC
Bộ ống nghiệm thử phản ứng IMViC gồm 5 ống:
Indole: Tryptone, thử bằng thuốc thử Kowac’s (1 giọt). Ống nghiệm dương tính khi có vòng tròn đỏ trên bề mặt.
MR (Methyl Red): thử bằng thuốc thử Methyl red (1 giọt). Ống nghiệm dương tính khi có vòng đỏ trên bề mặt.
VP (Voges – Proskauer): thử lần lượt bằng 1 giọt thuốc thử A (5% α – naphthol trong cồn tuyệt đối) và 1 giọt thuốc thử B (NaOH 40%). Ống nghiệm âm tính khi không làm đổi màu môi trường.
Simmon Citrate Agar (SC - thạch nghiêng): ống nghiệm âm tính khi môi trường vẫn giữ nguyên không chuyển sang màu xanh dương.
Kligler Iron Agar (KIA): ống nghiệm dương tính khi có sinh hơi.
Đọc kết quả: Phản ứng IMViC thử E. coli dương tính khi: Indole: (+), MR: (+), VP: (-), KIA: (+), SC: (-), nghĩa là mẫu nhiễm E. coli.
Hình 3.3 Khuẩn lạc S. aureus Hình 3.4 Cấy thuần S. aureus trên BPA
26
Hình 3.5 Khuẩn lạc E. coli trên EMB Hình 3.6 Phản ứng Catalase
Hình 3.7 Phản ứng đông huyết tương Hình 3.8 Phản ứng dung huyết
Hình 3.9 Thử nghiêm IMViC để xác định E. coli:
Ống A: Citrate (-) Ống B: KIA (+) Ống C: MR (+) Ống D: VP (-) Ống E: Indole (+)
(Hình ghi nhận được trong lúc thực hiện đề tài)
27