bằng phương pháp làm kháng sinh đồ
Tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được kiểm tra bằng phương pháp kháng sinh đồ dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trên thạch đĩa của
Kirby-Bauer (Bauer et al., 1966) và đường kính vòng vô khuẩn để đánh giá mức
độ nhạy của vi khuẩn đối với một số kháng sinh ở mục 3.2.2. 3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi
Số mẫu gà viêm khớp - Tỷ lệ gà mắc bệnh viêm khớp (%) = x 100% Tổng đàn khảo sát - Số vi khuẩn nhạy - Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với từng loại kháng sinh = x 100%
Tổng số chủng khảo sát 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Phần mềm MS-Excel được sử dụng để tính toán số liệu: tổng, tỷ lệ,…
Phép thử Chi-square của phần mềm Minitab 13.0 được sử dụng để so sánh các tỷ lệ.
Số mẫu dương tính với từng loại vi khuẩn
Tổng mẫu khảo sát Tỷ lệ phát hiện từng loại vi khuẩn
23
3.4 Kỹ thuật phòng thí nghiệm
3.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu 3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu
Mẫu dùng phân lập vi khuẩn là dịch ở khớp gối hoặc dịch ở gan bàn chân. Những mẫu này được thu thập khi mổ khám những con gà có biểu hiện viêm khớp để kiểm tra bệnh tích đại thể. Dùng tăm bông vô trùng thu lấy dịch ở khớp gối cho vào ống Carry Blair, trữ lạnh ở 4-80C và vận chuyển về phòng xét nghiệm để phân lập vi khuẩn ngay. Trên các mẫu này ghi lại ngày, tháng lấy mẫu, địa điểm, loại bệnh phẩm, giống và lứa tuổi của gà mắc bệnh. 3.4.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn
Quy trình phân lập S. aureus được thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 3.1 Quy trình định tính Staphylococcus aureus
(TCVN 4830-1:2005) Mẫu (tămpon)
Ria lên thạch BPA, ủ ở 370C/24 giờ
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang NA, ủ 370C/24 giờ Khẳng định Staphylococcus aureus Thử nghiệm Oxydase (-) Catalase (+) Đông huyết tương (+) Dung huyết (+)
24
Quy trình phân lập E. coli được thực hiện theo qua sơ đồ sau:
Hình 3.2 Quy trình định tính Escherichia coli
(TCVN 7924-1:2008) Các phản ứng sinh hóa
Phản ứng dung huyết
Dùng que cấy vô trùng cấy sinh khối vi khuẩn đã được làm thuần lên môi trường Blood Agar, đem ủ trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả
Staphylococcus aureus làm dung huyết trên môi trường thạch máu. Phản ứng đông huyết tương
Dùng que cấy vô trùng cấy vi khuẩn đã làm thuần vào trong ống eppendorf chứa 1,5 ml huyết tương thỏ, trộn đều, ủ ở 370C sau 4 - 24 giờ đọc kết quả.
Phản ứng dương tính: khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức
độ đông kết đều được xem là dương tính). Đó là Staphylococcus aureus.
Phản ứng âm tính: khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng
nhất như ống không cấy. Đó là Staphylococcus spp. khác.
Phản ứng Catalase
Lấy khuẩn lạc từ môi trường NA phết vào phiến kính rồi nhỏ dung dịch H2O2 3%. Đọc kết quả: phản ứng dương tính khi có hiện tượng sủi bọt trên phiến kính. Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt trên phiến kính.
Phản ứng Oxydase
Lấy khuẩn lạc từ môi trường NA cho vào đĩa thuốc thử Oxydase có nhỏ sẵn dung dịch nước muối sinh lý 9‰. Đọc kết quả: phản ứng dương tính khi môi
Mẫu (tămpon)
Ria lên thạch EMB, ủ ở 370C/24 giờ
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang NA, ủ 370C/24 giờ
Khẳng định E. coli
Thử nghiệm IMViC
MR (+)
25
trường chuyển sang màu tím đen. Phản ứng âm tính khi không làm đổi màu môi trường.
Phản ứng sinh hóa IMViC
Bộ ống nghiệm thử phản ứng IMViC gồm 5 ống:
Indole: Tryptone, thử bằng thuốc thử Kowac’s (1 giọt). Ống nghiệm dương tính khi có vòng tròn đỏ trên bề mặt.
MR (Methyl Red): thử bằng thuốc thử Methyl red (1 giọt). Ống nghiệm dương tính khi có vòng đỏ trên bề mặt.
VP (Voges – Proskauer): thử lần lượt bằng 1 giọt thuốc thử A (5% α – naphthol trong cồn tuyệt đối) và 1 giọt thuốc thử B (NaOH 40%). Ống nghiệm âm tính khi không làm đổi màu môi trường.
Simmon Citrate Agar (SC - thạch nghiêng): ống nghiệm âm tính khi môi trường vẫn giữ nguyên không chuyển sang màu xanh dương.
Kligler Iron Agar (KIA): ống nghiệm dương tính khi có sinh hơi.
Đọc kết quả: Phản ứng IMViC thử E. coli dương tính khi: Indole: (+), MR: (+), VP: (-), KIA: (+), SC: (-), nghĩa là mẫu nhiễm E. coli.
Hình 3.3 Khuẩn lạc S. aureus Hình 3.4 Cấy thuần S. aureus trên BPA
26
Hình 3.5 Khuẩn lạc E. coli trên EMB Hình 3.6 Phản ứng Catalase
Hình 3.7 Phản ứng đông huyết tương Hình 3.8 Phản ứng dung huyết
Hình 3.9 Thử nghiêm IMViC để xác định E. coli:
Ống A: Citrate (-) Ống B: KIA (+) Ống C: MR (+) Ống D: VP (-) Ống E: Indole (+)
(Hình ghi nhận được trong lúc thực hiện đề tài)
27
3.4.2 Phương pháp làm kháng sinh đồ
Chuẩn bị canh khuẩn
Vi khuẩn đã được định danh, tiến hành ria cấy trên đĩa thạch môi trường TSA, cho vào tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Kế đó dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa 2ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% và lắc đều khi độ đục trong ống nghiệm bằng độ đục của ống nghiệm chứa dung dịch chuẩn Mac Farland 0.5.
Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ
Dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào ống canh khuẩn đã chuẩn bị, kéo lên thành ống cho ráo bớt nước. Sau đó, lấy ra dàn đều vi khuẩn lên trên mặt thạch môi trường MHA dày khoảng 4 mm. Chờ cho mặt thạch khô, dùng kẹp vô trùng gấp các đĩa giấy tẩm kháng sinh đặt trên mặt thạch. Sau đó, cho đĩa thạch đã đặt kháng sinh vào tủ ấm ở 370C/ 24 giờ.
Hình 3.10 Cách đặt đĩa giấy kháng sinh
(Hình ghi nhận được trong lúc thực hiện đề tài) Đọc kết quả kháng sinh đồ
Đọc kết quả kháng sinh đồ bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn (mm). Vi khuẩn được cho là nhạy với kháng sinh khi kích thước vòng vô khuẩn nằm trong khoảng giới hạn trung bình và nhạy với kháng sinh, vi khuẩn được cho là kháng với kháng sinh khi kích thước đường kính vòng vô khuẩn nằm trong khoảng giới hạn kháng với kháng sinh theo bảng tiêu chuẩn đo đường kính vòng vô khuẩn (bảng 3.1).
28
Bảng 3.1 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ nhạy của vi khuẩn đối với một số kháng sinh dựa trên đường kính vòng vô khuẩn (CLSI, 2011)
STT Kháng sinh
Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Nhạy Trung bình Kháng 1 Ampicillin 10 µg ≥ 17 14-16 ≤ 13 ≥ 29* - ≤ 28* 2 Cefalor 30 µg ≥ 18 15-17 ≤ 14 3 Doxycillin 30 µg ≥ 14 11-13 ≤ 10 4 Erythromycin 15 µg ≥ 23 14-22 ≤ 13 5 Gentamicin 10 µg ≥ 15 13-14 ≤ 12 6 Neomycin 30 µg ≥ 17 13-16 ≤ 12 7 Norfloxacin 10 µg ≥ 17 13-16 ≤ 12 8 Trimethoprim-sulfamethoxazol 25 µg ≥ 16 11-15 ≤ 10 Ghi chú: *
29
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả chẩn đoán bệnh viêm khớp qua dấu hiệu lâm sàng
Kết quả khảo sát thực tế tình hình vệ sinh thú y phòng bệnh được tổng hợp ở bảng 4.1 cho thấy công tác vệ sinh thú y phòng bệnh ở 13 trại gà khảo sát tại 4 huyện Thống Nhất, Xuân Lộc, Trảng Bom và Long Khánh được thực hiện rất nghiêm ngặt, với 100% trại gà thực hiện quy trình sát trùng chuồng trại giữa 2 đợt nuôi, bỏ trống chuồng trại 2- 3 tuần trước khi nhập gà và sát trùng định kỳ 2-3 lần/tuần. Kết quả khảo sát cũng cho thấy 13/13 trại gà (100%) chăn nuôi sử dụng thức ăn công nghiệp và chỉ có 10/13 trại, chiếm tỷ lệ 76,92% (trong đó có 4 trại ở Xuân Lộc và 3 trại ở Trảng Bom) có sử dụng nước đã qua xử lý. Những trại gà khảo sát đều là những trại gà chăn nuôi theo hình thức công nghiệp với quy mô lớn, do đó việc áp dụng các quy trình chăn nuôi và phòng bệnh chặt chẽ là rất cần thiết để đảm bảo đàn gà tăng trọng nhanh trong thời gian nuôi ngắn, giảm thiểu các nguy cơ gây tổn thất nhằm tối đa hóa lợi nhuận kinh tế.
Việc định kỳ vệ sinh tiêu độc sát trùng cho cơ sở chăn nuôi là một biện pháp chủ động để loại trừ mầm bệnh giúp cho người nuôi phòng ngừa được các dịch bệnh nguy hiểm. Nếu việc thực hiện không đúng cách như không làm vệ sinh trước khi phun thuốc, chọn loại thuốc hoặc sử dụng liều lượng, cách pha, cách phun xịt không phù hợp với đối tượng tiêu độc… sẽ gây lãng phí công sức, tiền của mà dịch bệnh vẫn xảy ra.
30 Bảng 4.1: Tình trạng vệ sinh ở các trại chăn nuôi tại tỉnh Đồng Nai
Địa điểm Tình trạng vệ sinh thú y
Thống Nhất Xuân Lộc Trảng Bom Long Khánh
N n TL (%) N n TL (%) N n TL (%) N n TL (%)
Sát trùng giữa 2 đợt nuôi
Bỏ trống chuồng 2-3 tuần trước khi nhập Sát trùng định kỳ 2-3 lần/tuần
Sử dụng nước đã qua xử lý Sử dụng thức ăn công nghiệp
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 100 100 100 100 100 5 5 5 5 5 5 5 5 4 5 100 100 100 80 100 5 5 5 5 5 5 5 5 3 5 100 100 100 60 100 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 100 100 100 100 100
31
4.1.1 Tỷ lệ gà mắc bệnh viêm khớp
Kết quả chẩn đoán bệnh viêm khớp trên đàn gà khảo sát tại các huyện thuộc tỉnh Đồng Nai được thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2 Tỷ lệ gà mắc bệnh viêm khớp tại bốn huyện ở tỉnh Đồng Nai
Địa điểm Số gà khảo sát (con) Số gà viêm khớp (con) Tỷ lệ (%) P Thống Nhất Xuân Lộc Trảng Bom Long Khánh 5.920 38.880 33.720 15.600 59 1.812 441 117 0,99c 4,66a 1,31b 0,75c 0,00 Tổng 94.120 2.429 2,58
Các giá trị trong cùng một cột với chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa (P<0,05)
Kết quả bảng 4.2 cho thấy số lượng gà bị viêm khớp là 2.429 con so với tổng đàn 94.120 con (chiếm tỷ lệ 2,58%). Điều này ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến năng suất chăn nuôi, gây thiệt hại kinh tế cho nền công nghiệp chăn nuôi gia cầm. Viêm khớp là một bệnh phổ biến và tỷ lệ mắc bệnh ngày càng tăng ở gia cầm trong ngành công nghiệp chăn nuôi hiện đại, đặc biệt là ở các giống gà thịt tăng trọng nhanh (Mohnl, 2012). Hậu quả làm gà bị què, đi lại khó khăn ảnh hưởng tới sự vận động và tranh giành thức ăn. Nếu nuôi trong mật độ quá đông gà sẽ bị thiếu thức ăn và nước uống sau đó dẫn đến tình trạng gà bị stress nặng, tạo điều kiện cho mầm bệnh khác xâm nhập dẫn đến chết.
Kết quả trên cũng cho thấy, tỷ lệ gà bị bệnh viêm khớp khác nhau theo từng địa bàn. Cụ thể là ở địa bàn huyện Xuân Lộc (4,66%), Thống Nhất (0,99%), Trảng Bom (1,31%), Long Khánh (0,75%), sai khác có ý nghĩa thống kê (P=0,00). Nguyên nhân có thể do khác nhau về điều kiện chăm sóc quản lí, chế độ dinh dưỡng và lứa tuổi gà khảo sát. Đàn gà khảo sát ở huyện Xuân Lộc thuộc các giống gà đẻ 10-30 tuần tuổi, thời gian sống lâu hơn nên có nhiều khả năng nhiễm mầm bệnh hơn do đó khả năng mắc bệnh là cao hơn. Ở các huyện còn lại, gà được nuôi ở các trại này là gà thịt, với thời gian nuôi từ 3-5 tuần tuổi (Thống Nhất), 5-8 tuần tuổi (Trảng Bom) và 4-5 tuần tuổi (Long Khánh) thời gian sống ngắn nên khả năng phơi nhiễm với mầm bệnh là thấp hơn.
4.1.2 Những biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể
Những biểu hiện lâm sàng
Kết quả ghi nhận những biểu hiện lâm sàng quan sát được từ 163 con gà bị viêm khớp được trình bày ở bảng 4.3.
32
Bảng 4.3 Tỷ lệ các biểu hiện lâm sàng ghi nhận được trên gà viêm khớp (n=163)
Biểu hiện lâm sàng Tần suất xuất hiện Tỷ lệ (%)
Ít vận động, kém nhanh nhẹn Lông xơ xác, sụt cân
Sưng khớp gối Què một chân Què cả hai chân
Sưng khớp bàn và gan bàn chân
163 159 136 107 56 48 100,00 97,54 83,43 65,64 34,36 29,45 Kết quả khảo sát triệu chứng lâm sàng ở bảng 4.3 cho thấy, gà mắc bệnh có biểu hiện triệu chứng ít vận động, động tác kém nhanh nhẹn chiếm tỷ lệ cao nhất (100%), kế đến là triệu chứng xù lông, lông xơ xác, sụt cân (97,54%), sưng khớp gối (83,43%), ngoài ra còn ghi nhận được các triệu chứng như què một chân (65,64%) và què cả hai chân (34,36%). Kết quả khảo sát này cũng là những triệu chứng đặc trưng của bệnh viêm khớp trong nghiên cứu của (Andreasen, 2003), triệu chứng điển hình của bệnh viêm khớp gồm xù lông, gầy ốm, què một chân hoặc hai chân, cánh rủ xuống, miễn cưỡng đi lại, sốt, dẫn đến chết hoặc không đi lại được do khớp bị sưng nặng. Ngoài ra, gà bị sưng khớp bàn chân và sưng gan bàn chân chiếm một tỷ lệ khá cao (29,45%), gà có triệu chứng này thường có khớp viêm nặng hơn, đi lại khó khăn hơn và gầy yếu hơn những con khác, do trọng lượng cơ thể dồn lên chân. Điều này cũng phù hợp nhận định của Jensen và Miller (2001). Các tác giả này cho rằng bệnh viêm khớp ở giai đoạn gà 24 đến 30 tuần tuổi thường biểu hiện triệu chứng viêm và áp xe ở lòng bàn chân do stress từ việc di chuyển đàn, giao phối và giai đoạn chuẩn bị đẻ, vết thương do việc gây hấn giữa các con trống, xây xát tổn thương từ nền chuồng hoặc các dụng cụ chăn nuôi.
Hình 4.1 Gà bệnh bị què không thể đứng dậy
33
Bệnh tích đại thể
Kết quả quan sát bệnh tích từ 163 gà bị viêm khớp được thể hiện ở bảng 4.4 Bảng 4.4 Tỷ lệ các bệnh tích ghi nhận được trên gà bệnh viêm khớp (n=163)
Cơ quan Bệnh tích Tần suất xuất hiện Tỷ lệ (%) Khớp gối Sưng
Sưng nóng, đỏ Sưng nóng, hơi xanh Có dịch viêm
Có mủ
Có chất như bã đậu Sưng một khớp chân Sưng cả hai khớp chân
62 61 13 47 29 22 93 43 38,04 37,42 7,36 28,83 17,79 13,50 57,06 26,38
Gan bàn chân Sưng đỏ 17 10,43
Kết quả bảng 4.4 cho thấy, bệnh tích tập trung chủ yếu lên khớp gối, sưng một khớp chân (57,06%) và sưng cả hai khớp chân (26,38%), trong đó bao gồm sưng (38,04%); sưng nóng, đỏ (37,42%) và sưng nóng, hơi xanh (7,36%). Ngoài ra trong khớp viêm còn có chứa dịch viêm (28,83%), có mủ (17,79%) và có chất bã đậu (13,50%). Bên cạnh đó, bệnh tích còn quan sát được trên gan bàn chân là sưng đỏ (10,43%). Bệnh tích phù hợp với nghiên cứu của Rasheed (2011), kết quả nghiên cứu cho rằng khoảng 80% khớp bị viêm sẽ có triệu chứng sưng khớp gối và què, khi mổ khám thì thấy có dịch rỉ viêm màu trắng đến vàng. Theo
Jordan et al. (2002), nhiễm trùng khớp đặc biệt là ở khớp gối thì thường nóng,
sưng đau, có chứa dịch viêm có fibrin, khó đi lại và có thể bị què.
Hình 4.2 Khớp gà bị sưng Hình 4.3 Gan bàn chân gà bị sưng
34
4.2 Kết quả phân lập một số vi khuẩn S. aureus & E. coli trên khớp gà 4.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn S. aureus & E. coli trên gà bị viêm khớp
Bảng 4.5 Tỷ lệ gà bệnh nhiễm vi khuẩn tại các huyện ở tỉnh Đồng Nai
Địa điểm Số mẫu
xét nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Thống Nhất Xuân Lộc Trảng Bom Long Khánh 12 80 51 20 3 39 9 4 25,00ab 48,75a 17,65b 20,00b Tổng 163 55 33,74
Các giá trị trong cùng một cột với chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa (P<0,05)
Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy, trong 163 mẫu gà có biểu hiện của bệnh viêm khớp thì có 55 trường hợp viêm khớp do nhiễm vi khuẩn, chiếm tỷ lệ 33,74%, trong đó Xuân Lộc chiếm tỷ lệ cao nhất (48,75%), kế đến là Thống Nhất (25%), Long khánh (20%) và Trảng Bom (17,65%).
Kết quả tỷ lệ gà viêm khớp do nhiễm khuẩn này thấp hơn nghiên cứu của Rasheed (2011) với 85% gà thịt bị viêm khớp do vi khuẩn. Sự khác biệt này có thể được lý giải do, viêm khớp là bệnh có rất nhiều nguyên nhân gây ra. Kết luận
này cũng phù hợp với nghiên cứu của Butterworth et al. (2009). Nhóm tác giả
này nhận định rằng có 3 nguyên nhân chủ yếu gây viêm khớp là rối loạn trao đổi chất, biến dạng xương trong quá trình phát triển và nhiễm trùng. Trong đó, việc rối loạn trao đổi chất chủ yếu là do ảnh hưởng bởi thành phần dinh dưỡng của thức ăn; các yếu tố tác động gây biến dạng xương trong quá trình phát triển bao