loài vi khuẩn X. campestris pv. campestris hại cây rau họ hoa thập tự
2.5.2.1. Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn
Phương pháp phân lập vi khuẩn theo Bradbury (1986); Schaadd et al. (2001). Từ những vết bệnh thu thập được ngoài đồng ruộng, chúng tôi tiến hành kiểm tra xác định sơ bộ tác nhân gây bệnh. Chọn những mẫu bệnh mới, vết bệnh trung bình, điển hình sau đó rửa sạch. Chuẩn bị dụng cụ: dao, panh, giấy thấm vô trùng, que cấy vi khuẩn, cốc thủy tinh đựng cồn 70%, nước cất, bàn thái.
Khử trùng buồng cấy bằng cồn 70%. Nhúng panh và dao mổ trong cồn 70% và hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Đồng thời nhúng nhanh mẫu bệnh vào cồn 70%, rửa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18 lại trong nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng. Khử trùng một lam kính và nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam, nhẹ nhàng lau khử trùng bề mặt lá bằng giấy thấm cồn. Dùng những dụng cụ đã khử trùng cắt những mẫu bệnh nhỏ từ vết bệnh và đưa sang giọt nước trên lam kính. Quan sát dịch vi khuẩn đùn ra từ vết bệnh trên kính hiển vi. Cắt nhỏ, chà sát miếng cắt để giải phóng vi khuẩn vào giọt nước, để
khoảng 5 phút để vi khuẩn có thời gian giải phóng vào giọt nước. Nhúng que cấy vi khuẩn đã được khử trùng vào giọt nước và cấy lên môi trường. Bọc đĩa lại bằng nilon gói thực phẩm và đểở nhiệt độ 290C để vi khuẩn phát triển.
Theo dõi và kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn. Quan sát đặc điểm phát triển của vi khuẩn trên môi trường: hình thái, màu sắc khuẩn lạc, bề mặt khuẩn lạc.
Cấy truyền vi khuẩn: Chọn đĩa petri có nguồn vi khuẩn, tiến hành khử trùng que cấy vi khuẩn. Sau đó dùng que cấy và cấy vi khuẩn từ đĩa petri có nguồn vào
đĩa petri có môi trường mới. Cấy thuần nhằm tạo nguồn bệnh vi khuẩn cho thí nghiệm nhà lưới.
* Thử phản ứng Gram của vi khuẩn gây bệnh
Thử KOH 3% để phân biệt vi khuẩn Gram âm và Gram dương theo phương pháp nghiên cứu của Gregerson (1978).
Khử trùng buồng cấy, lam kính, que cấy vi khuẩn bằng cồn 70%. Nhỏ 1 giọt KOH 3% vào lam kính, lấy que cấy vi khuẩn đã khử trùng lấy vi khuẩn ở môi trường đã nuôi cấy cho vào lam đã nhỏ giọt KOH 3%, sau đó dùng que cấy vi khuẩn đó ray khuẩn lạc một lúc và khi kéo vi khuẩn lên thấy sợi, kết luận vi khuẩn
đó có phản ứng Gram (-).
2.5.2.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các mẫu phân lập vi khuẩn X. campestris pv. campestris
Tiến hành nuôi cấy các isolates của vi khuẩn X. campestris pv. campestris
trên môi trường nhân tạo SPA, PPSA ở cùng một ngưỡng nhiệt độ 30oC, sau đó theo dõi đặc điểm hình thái, màu sắc bề mặt khuẩn lạc sau 24h, 48h và 72h nuôi cấy trên môi trường nhân tạo.
2.5.2.3. Nghiên cứu khả năng phát triển của các vi khuẩn X. campestris pv.
campestris phân lập từ các cây ký chủ nhiễm bệnh trên một số môi trường nhân tạo SPA và PPSA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19
* Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của khuẩn lạc các mẫu phân lập vi khuẩn X. campestris pv. campestris
Cấy các mẫu vi khuẩn được phân lập từ các giống cải bắp nhiễm bệnh trên môi trường SPA, PPSA, đặt trong điều kiện nhiệt độ 30oC. Mỗi môi trường lặp lại 3
đĩa petri cho một mẫu vi khuẩn.
Tiến hành đo khuẩn lạc vi khuẩn của mẫu phân lập được cấy trên các môi trường sau 24, 48, 72 giờ nuôi cấy.
* Ảnh hưởng của các ngưỡng nhiệt độ đến sự phát triển của khuẩn lạc các mẫu phân lập vi khuẩn X. campestris pv. campestris
Các mẫu vi khuẩn được phân lập được trên các giống cải bắp nhiễm bệnh
được nuôi cấy trên môi trường SPA. Được đặt ở các ngưỡng nhiệt độ 25, 30, 35, 40oC. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa petri. Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn sau 72 giờ.
2.5.2.4. Thử một số phản ứng sinh hóa của các mẫu phân lập vi khuẩn X. campestris pv. campestris
Áp dụng theo tài liệu mô tả của Bradbury (1986); Schaadd et al. (2001). * Thử nghiệm Oxidase
Làm ướt thanh giấy lọc đã được sấy vô khuẩn từ trước bởi thuốc thử oxidase (tetramethyl-p-phenylenediamine hydrochloride), lấy que cấy đã vô trùng gạt 1 khuẩn lạc và quệt lên giấy đã tẩm thuốc thử oxidase.
Quan sát kết quả trong vòng 10 giây đầu. Phản ứng (+) cho kết quả màu xanh tím.
* Thử enzyme oxy hóa Catalase
Mục đích: Kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalaza.
Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính. Dùng
đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hóa (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính. Sau đó khuấy vi khuẩn và quan sát sau 1 – 2 giây, nếu có bọt khí xuất hiện thì vi khuẩn có phản ứng dương nếu không có bọt khí xuất hiện thì vi khuẩn không có phản ứng, âm tính.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 Môi trường: Pepton 10g, NaCl 5g, Cao thịt 10g, Cystein 0,5g nước cất 1000 ml, pH = 7,0-7,4
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 1210C trong 20- 30 phút. Cắt giấy lọc thành dải rộng 0,5-1cm, độ dài tùy thuộc vào ống nghiệm và
độ cao của môi trường. Tẩm vào giấy dung dịch chì-acetat PbCH3(COO)2 , sấy khô giấy trong tủ sấy đặt trong đĩa petri và khử trùng. Cấy vi khuẩn mới hoạt hóa (18-24 giờ). Dùng panh vô khuẩn gắp giấy tẩm chì-acetat đưa vào từng ống nghiệm, dài
đến nút bông nhưng không chạm vào môi trường. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ thích hợp, sau 3,7,14 ngày quan sát. Nếu giấy biến đen là phản ứng dương tính, nếu không đổi mầu thì là âm tính.
* Phản ứng tạo NH3
Môi trường: Peptone 5g, NaNO2 1g, nước cất 1000 ml, pH = 7,3 - 7,4 Phân môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Chuẩn bị thuốc thử Griess:
Dung dịch 1: Acid sulfanilic 0,5g, acid acetic loãng (khoảng 10%) 150 ml. Dung dịch 2: Alpha naphtylamin 0,1g, nước cất 20 ml, acid acetic loãng (khoảng 10%) 150 ml.
Cấy vi khuẩn, đặt ở 300C trong 1, 3, 7 ngày rồi làm phản ứng xác định. Nhỏ
vào dịch nuôi cấy 1 giọt dung dịch 1 và 1 giọt dung dịch 2, lắc nhẹ. Nếu mất màu
đỏ và sinh ra NH3 là kết quả dương tính, nếu vẫn giữ màu đỏ là phản ứng âm tính. * Phản ứng thủy phân tinh bột
Môi trường: Bổ sung tinh bột tan (0.2%) vào môi trường nước thịt pepton, khử trùng ở 1210C trong 20 phút rồi đổ ra đĩa petri.
Lấy vi khuẩn mới hoạt hóa cấy vạch hay cấy chấm lên đĩa thạch. Sau 3 ngày nhỏ thuốc thử Lugol lên vết cấy để quan sát khả năng phân giải tinh bột. Nếu thuốc thử
Lugol không bắt màu quanh vết cấy tức là vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột.