Trong điều kiện cho phép chúng tôi tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 6 chất (I, II, IV, V, VI, IX), tại phòng thí nghiệm vi sinh — Bộ môn Vi sinh - ĐH Dược - Hà Nội.
2.4.1.1. Nguyên tắc.
Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch với các khoanh giấy lọc đã tẩm chất thử. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm được đáng giá bằng khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật, tạo thành các vòng vô khuẩn có đường kính tỉ lệ thuận với logarit nồng độ chất thử.
2.4.1.2. Chất thử.
Chất thử bao gồm 6 chất: I, II, IV, V, VI, IX được pha ở nồng độ 2mg/ml (0,2%) trong dung môi aceton.
Chất đối chiếu:
- Getamycin (Genta) pha ở nồng độ 20Ag/m l đối với chủng vi khuẩn Gram(+)
- Penicillin (Peni) pha ở nồng độ 20UI/ml đối với chủng vi khuẩn Gram(-) - Nipagin (Nip) pha ở nồng độ lmg/ml đối với vi nấm
2.4.1.3. Vi sinh vật kiểm định.
Giống vi sinh vật kiểm định do Bộ môn Vi Sinh cung cấp. Chúng tôi tiến hành thử trên 8 chủng vi khuẩn, 2 chủng vi nấm.
* 4 chủng vi khuẩn Gram (+):
- Bacillus subtilis (BS) ATTC 6633 - Sarcina lutea (SL) ATCC9341
- Staphylococcus aureus (Sta) ATCC1228
* 4 chủng vi khuẩn Gram (-):
- Escherichia coli (EC) ATCC25922 - Pseudomonas aeruginosa (Pseu) VM201 - Salmonella typhi (Sal) DT220
- Shigella Ịĩexneri (Shi) DT112 * 2 chủng vi nấm:
- Aspergillus niger (As) - Candida albicans (Cd) 2.4.1.4. M ôi trường dinh dưỡng
* Môi trường canh thang:
Cao thịt 0,3%
Pepton 0,5%
NaCl 0,5%
Nước cất vđ 15ml * Môi trường thạch thường:
Cao thịt 0,3%
Pepton 0,5%
NaCl 0,5%
Thạch 1,6%
Nước cất vđ 480ml * lOml dung dịch Tween 80 0,2% * Môi trường Sabouraud lỏng:
Glucose 2%
Pepton 1 %
Nước cất vđ lOml * Môi trường Sabouraud:
Glucose 2%
Thạch 1,6%
Nước cất vđ 120ml
2.4.1.5. Tiến hành.
- Các môi trường nuôi cấy được tiệt trùng ở 120°c trong 20 phút trước khi sử dụng.
- Chuẩn bị nhũ dịch vi sinh vật nồng độ ÌO6 — 107 tế bào/ml. Bằng cách dùng chủng chỉ thị mới phát triển trên thạch nghiêng sau 24 giờ, cấy truyền vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 4,5ml môi trường canh thang, cấy truyền
Candida albicans vào ống nghiệm chứa 4,5ml môi trường Sabouraud lỏng, cấy truyền Aspegillus niger vào ống nghiệm chứa 4,5ml dung dịch Tween 80. Các Ống nghiệm được ủ ấm ở 37°c trong 24 giờ, sau đó lấy ra dùng.
- Nhũ dịch vi khuẩn được cấy vào môi trường thạch thường, nhũ dịch vi nấm được cấy vào môi trường Sabouraud đặc ở nhiệt độ 50 — 60°c, lắc đều, đổ vào các đĩa petri với thể tích 20ml/đĩa.
- Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định: Có 3 cách đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định:
Đặt khoanh giấy lọc Đục lỗ thạch
Đặt khối thạch
Ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp đặt khoanh giấy lọc (d = 7 mm), khoanh giấy lọc có tẩm chất thử được đặt trên bề mặt môi trường kiểm định.
- Nuôi cấy: Các đĩa petri có mẫu thử được nuôi cấy ở 37°c đối với vi khuẩn, ở 30°c đối với vi nấm, trong 18 — 24 giờ.
- Mỗi mẫu được thử trên 3 đĩa đối với mỗi chủng vi sinh vật. Đường kính vòng vô khuẩn đo bằng thước kẹp parmer có độ chính xác 0,02 mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn. Kết quả thể hiện ở bảng 9. Hình ảnh minh hoạ tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm được trình bày ở phần phụ lục 4.
Bảng 9. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất I, II, IV, V, VI, IX (ở nồng độ 2 mg/ml, đường kính vòng vô khuẩn được tính bằng mm
Chất Chủng
Đường kính vòng vô khuẩn
I I I IV V V I IX Peni Genta Nip
Baciỉlus pumilus - - - - - 20,35 19,50 Bacillus s u b t ilis - - - 8,82 - 18,15 19,80 Sarcina lutea - - - - - 18,51 18,60 Staphylococcus aureus - - - 7,55 - 14,31 15,60 Escherichia co li - - - 8,33 - 18,97 19,19 Pseudomonas aerugỉnosa - 11,31 - - - 19,89 18,21 Salmonella typhi - - - 8,12 - 15,10 17,13 Shigella flexneri - - - 7,96 - 18,30 18,56 Aspergillus niger - - - - - 19,20 14,7 Candida albicans - - - - - 20,23 -
Ghi chú. ( - ) : Kết quả âm tính. 2.4.1.6. Kết quả.
Từ những kết quả thu được trên, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau: - Ở nồng độ 2mg/ml chất II có tác dụng trên một chủng vi khuẩn là
Pseudomonas aeruginosa so sánh với chất đối chiếu là gentamycin thấy tác dụng này rất yếu.
- Chất V có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram(+), Gram(-). So sánh với chất đối chiếu là penicillin và gentamycin thì thấy chất IV có tác dụng nhưng rất yếu.
- Chất IX có tác dụng trên 8 chủng vi khuẩn kiểm định. So sánh với chất đối chiếu thì thấy chất IX có tác dụng mạnh gần bằng chất chất đối chiếu.
- Kết quả thử trên nấm cho thấy chỉ chất IX có tác dụng mạnh trên cả 2 chủng nấm, còn các chất khác đều không có tác dụng. So sánh với chất đối chiếu là Nipagin, chúng tôi thấy chất IX có tác dạng mạnh hơn so với Nipagin đối với cả 2 chủng vi nấm đã thử.
♦♦♦ Nhân xét vế mối liên quan cấu trúc - tác dung.
- Trong 6 chất đem thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chúng tôi nhận thấy chất trung gian 4- amino-4H- 1,2,4- triazol hoàn toàn không có tác dụng sinh học và azomethin của 4- amino- 4H- 1,2,4- triazol với Benzaldehyd (chất II) có tác dụng rất yếu trên một chủng vi khuẩn. Khi thế các nhóm chức vào vị trí C3, C4 của Benzaldehyd, nhận thấy chỉ khi thế nhóm C1 mới xuất hiện tác dụng nhưng tác dụng này rất yếu, còn các nhóm chức khác hoàn toàn không có tác dụng. Kết quả trên cho thấy khi thêm nhóm C1 vào phân tử của một chất có hoạt tính sinh vật thường đi đến kết quả là tăng hoạt tính của chất đó.
- Azomethin của 4- amino- 4H-1,2,4- triazol với furfural (chất VIII) không có tác dụng sinh học. Nhưng khi thế nhóm N 0 2 vào vị trí C5 của furfural thì lại cho chất IX có tác dụng tốt trên cả vi khuẩn và vi nấm, chứng tỏ các dẫn chất của 5 nitro furfural có tác dụng tốt.