Tại phòng thí nghiệm trung tâm — trường ĐH Dược Hà Nội, 9 chất (I — IX) đã được ghi phổ tử ngoại (UV) trên máy Carry IE UV- Visible Spectrophotometer varian trong dung môi EtOH tuyệt đối. Các gía trị Ầmax được trình bày ở bảng 7. Các phổ đồ được in ở các phụ lục 2.1 — 2.9 .
Bảng 7. Giá trị Ẳmax của các chất tổng hợp được.
Sô chất EtOH A,max (nm) I 203 II 214 278 ffl 204 260 IV 207 298 385 V 217 283 VI 203 243 362 VII 204 235 300 325 VIII 204 298 IX 240 333 1
* Biên giải phổ tử_ ngoai. [10] [17]
- Phổ tử ngoại thu được chứng tỏ sự hấp thụ mạnh ở vùng tử ngoại của các chất tổng hợp được do cấu trúc có chứa các hệ liên hợp 71-71 và p-7T (vòng benzen, vòng 1,2,4- triazol, vòng furan và các nhóm thế —C=N, N 0 2, OH,
o c h3..).
- Phổ tử ngoại của chất I chỉ có một cực đại ở 203 nm được quy cho chuyển mức 71-71 của vòng triazol.
cực đại ở các vùng 203 — 207 nm, 214 — 243 nm, 260 — 300 nm, và 325 — 385 nm. Các cức đại này xuất hiện do hệ liên hợp của phân tử được mở rộng với các vòng bezen, furan và các nhóm —C=N và các nhóm khác như N 0 2 ,
o c h3 , - OH , Cl.
- X max ờ hai vùng (203 — 207 nm và 214 — 243 nm) được quy cho chuyển mức năng lượng 71-71 của vòng triazol, vòng benzen.
- X max ở hai vùng (260 — 300 nm và 325 — 385 nm) được quy cho chuyển mức năng lượng 71-71 của hệ liên hợp toàn phân tử. Có thể nhận xét các chất IV, VI, VII và IX có X max ở vùng bước sóng dài hơn các chất khác (325 — 385) do phân tử có hệ liên hợp rộng hơn các chất khác vì sự có mặt của các nhóm thế -N 02 (IV), N(CH3)2 (VI), -OH (VII) gắn vào vị trí para của nhân bezen và nhóm -N 02 gắn vào vị trí 5 của vòng furan.
2.3.4. Phân tích p h ổ khối lượng
Phổ khối lượng được ghi trên máy HP-5989B-MS, tại phòng phân tích cấu trúc — Viện hóa học — Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia. Do điều kiện hạn chế, chúng tôi chỉ tiến hành ghi phổ khối lượng của 2 chất đại diện là chất (IV) và chất (V).
Phổ đồ được in ở các phụ lục 3.1 — 3.2
Sơ đồ phân mảnh của chất V. m/z 151 m^z 138 -N2 + 1H CIhQ ^ C H m/z 124 - c f ▼ C7H5 m/z 89
Bảng 8. S ố liệu phổ khối lượng của chất IV, V. C h ấ t C ô n g th ứ c cấu tạo m / z IV 1 (M=217) 217 (m- ) 187 (M — NO) 162 ( M — 2HCN — 1H ) / = N 149 ( M- —N ) ==N 135 ( 162 — N2+ 1H) 89 (135 — N 0 2) V 1 (M=206) 206 ( m ! ) ; 2 0 8 ( m +2) 171 (206 — Cl) 151 ( M — 2HCN — 1H ) ỵ = N 138 ( M---- N ) \ = N 124 ( 151 — N2— 1H) 89 ( 124 — Cl)
* Biên giỏi phổ khối ịươn&i [9] [17]
Kết quả phân tích phổ khối lượng cho thấy hai chất (IV, V) đều có pic phân tử và có số khối đúng bằng số khối của chất dự kiến. Ở phổ đổ của chất (V) có pic M+2 với cường độ «1/3 cường độ pic phân tử, điều đó chứng tỏ có một nguyên tử clo trong phân tử chất V vì pic M+2 là pic của ion phân tử chứa đồng vị 37C1.
Ngoài ra, phổ khối lượng còn cho phép nhận ra các pic phân mảnh phù hợp với sơ đồ phân mảnh.
2.4. THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC.
Để đáng giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được với hy vọng tìm thấy các dẫn chất mới của 4- amino- 4H-1,2,4- triazol có hoạt tính sinh học, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và tác dụng
kháng các dòng tế bào ung thư ở người.
2.4.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm [6].
Trong điều kiện cho phép chúng tôi tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 6 chất (I, II, IV, V, VI, IX), tại phòng thí nghiệm vi sinh — Bộ môn Vi sinh - ĐH Dược - Hà Nội.
2.4.1.1. Nguyên tắc.
Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch với các khoanh giấy lọc đã tẩm chất thử. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm được đáng giá bằng khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật, tạo thành các vòng vô khuẩn có đường kính tỉ lệ thuận với logarit nồng độ chất thử.
2.4.1.2. Chất thử.
Chất thử bao gồm 6 chất: I, II, IV, V, VI, IX được pha ở nồng độ 2mg/ml (0,2%) trong dung môi aceton.
Chất đối chiếu:
- Getamycin (Genta) pha ở nồng độ 20Ag/m l đối với chủng vi khuẩn Gram(+)
- Penicillin (Peni) pha ở nồng độ 20UI/ml đối với chủng vi khuẩn Gram(-) - Nipagin (Nip) pha ở nồng độ lmg/ml đối với vi nấm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.1.3. Vi sinh vật kiểm định.
Giống vi sinh vật kiểm định do Bộ môn Vi Sinh cung cấp. Chúng tôi tiến hành thử trên 8 chủng vi khuẩn, 2 chủng vi nấm.
* 4 chủng vi khuẩn Gram (+):
- Bacillus subtilis (BS) ATTC 6633 - Sarcina lutea (SL) ATCC9341
- Staphylococcus aureus (Sta) ATCC1228
* 4 chủng vi khuẩn Gram (-):
- Escherichia coli (EC) ATCC25922 - Pseudomonas aeruginosa (Pseu) VM201 - Salmonella typhi (Sal) DT220
- Shigella Ịĩexneri (Shi) DT112 * 2 chủng vi nấm:
- Aspergillus niger (As) - Candida albicans (Cd) 2.4.1.4. M ôi trường dinh dưỡng
* Môi trường canh thang:
Cao thịt 0,3%
Pepton 0,5%
NaCl 0,5%
Nước cất vđ 15ml * Môi trường thạch thường:
Cao thịt 0,3%
Pepton 0,5%
NaCl 0,5%
Thạch 1,6%
Nước cất vđ 480ml * lOml dung dịch Tween 80 0,2% * Môi trường Sabouraud lỏng:
Glucose 2%
Pepton 1 %
Nước cất vđ lOml * Môi trường Sabouraud:
Glucose 2%
Thạch 1,6%
Nước cất vđ 120ml
2.4.1.5. Tiến hành.
- Các môi trường nuôi cấy được tiệt trùng ở 120°c trong 20 phút trước khi sử dụng.
- Chuẩn bị nhũ dịch vi sinh vật nồng độ ÌO6 — 107 tế bào/ml. Bằng cách dùng chủng chỉ thị mới phát triển trên thạch nghiêng sau 24 giờ, cấy truyền vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 4,5ml môi trường canh thang, cấy truyền
Candida albicans vào ống nghiệm chứa 4,5ml môi trường Sabouraud lỏng, cấy truyền Aspegillus niger vào ống nghiệm chứa 4,5ml dung dịch Tween 80. Các Ống nghiệm được ủ ấm ở 37°c trong 24 giờ, sau đó lấy ra dùng.
- Nhũ dịch vi khuẩn được cấy vào môi trường thạch thường, nhũ dịch vi nấm được cấy vào môi trường Sabouraud đặc ở nhiệt độ 50 — 60°c, lắc đều, đổ vào các đĩa petri với thể tích 20ml/đĩa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định: Có 3 cách đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định:
Đặt khoanh giấy lọc Đục lỗ thạch
Đặt khối thạch
Ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp đặt khoanh giấy lọc (d = 7 mm), khoanh giấy lọc có tẩm chất thử được đặt trên bề mặt môi trường kiểm định.
- Nuôi cấy: Các đĩa petri có mẫu thử được nuôi cấy ở 37°c đối với vi khuẩn, ở 30°c đối với vi nấm, trong 18 — 24 giờ.
- Mỗi mẫu được thử trên 3 đĩa đối với mỗi chủng vi sinh vật. Đường kính vòng vô khuẩn đo bằng thước kẹp parmer có độ chính xác 0,02 mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn. Kết quả thể hiện ở bảng 9. Hình ảnh minh hoạ tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm được trình bày ở phần phụ lục 4.
Bảng 9. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất I, II, IV, V, VI, IX (ở nồng độ 2 mg/ml, đường kính vòng vô khuẩn được tính bằng mm
Chất Chủng
Đường kính vòng vô khuẩn
I I I IV V V I IX Peni Genta Nip
Baciỉlus pumilus - - - - - 20,35 19,50 Bacillus s u b t ilis - - - 8,82 - 18,15 19,80 Sarcina lutea - - - - - 18,51 18,60 Staphylococcus aureus - - - 7,55 - 14,31 15,60 Escherichia co li - - - 8,33 - 18,97 19,19 Pseudomonas aerugỉnosa - 11,31 - - - 19,89 18,21 Salmonella typhi - - - 8,12 - 15,10 17,13 Shigella flexneri - - - 7,96 - 18,30 18,56 Aspergillus niger - - - - - 19,20 14,7 Candida albicans - - - - - 20,23 -
Ghi chú. ( - ) : Kết quả âm tính. 2.4.1.6. Kết quả.
Từ những kết quả thu được trên, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau: - Ở nồng độ 2mg/ml chất II có tác dụng trên một chủng vi khuẩn là
Pseudomonas aeruginosa so sánh với chất đối chiếu là gentamycin thấy tác dụng này rất yếu.
- Chất V có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram(+), Gram(-). So sánh với chất đối chiếu là penicillin và gentamycin thì thấy chất IV có tác dụng nhưng rất yếu.
- Chất IX có tác dụng trên 8 chủng vi khuẩn kiểm định. So sánh với chất đối chiếu thì thấy chất IX có tác dụng mạnh gần bằng chất chất đối chiếu.
- Kết quả thử trên nấm cho thấy chỉ chất IX có tác dụng mạnh trên cả 2 chủng nấm, còn các chất khác đều không có tác dụng. So sánh với chất đối chiếu là Nipagin, chúng tôi thấy chất IX có tác dạng mạnh hơn so với Nipagin đối với cả 2 chủng vi nấm đã thử.
♦♦♦ Nhân xét vế mối liên quan cấu trúc - tác dung.
- Trong 6 chất đem thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chúng tôi nhận thấy chất trung gian 4- amino-4H- 1,2,4- triazol hoàn toàn không có tác dụng sinh học và azomethin của 4- amino- 4H- 1,2,4- triazol với Benzaldehyd (chất II) có tác dụng rất yếu trên một chủng vi khuẩn. Khi thế các nhóm chức vào vị trí C3, C4 của Benzaldehyd, nhận thấy chỉ khi thế nhóm C1 mới xuất hiện tác dụng nhưng tác dụng này rất yếu, còn các nhóm chức khác hoàn toàn không có tác dụng. Kết quả trên cho thấy khi thêm nhóm C1 vào phân tử của một chất có hoạt tính sinh vật thường đi đến kết quả là tăng hoạt tính của chất đó.
- Azomethin của 4- amino- 4H-1,2,4- triazol với furfural (chất VIII) không có tác dụng sinh học. Nhưng khi thế nhóm N 0 2 vào vị trí C5 của furfural thì lại cho chất IX có tác dụng tốt trên cả vi khuẩn và vi nấm, chứng tỏ các dẫn chất của 5 nitro furfural có tác dụng tốt.
2.4.2. Thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người.
Do điều kiện hạn chế, chúng tôi chỉ tiến hành thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người đối với 2 chất (IV, V) để thăm dò hoạt tính kháng ung thư của dãy chất này.
2.4.2.1. Nguyên tắc.
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư được tiến hành theo mô hình thử nghiệm đang lưu hành và áp dụng tại viện nghiên cứu ung thư quốc gia mỹ (NCI).
Tế bào thử nghiệm có nguồn gốc tại các dòng tế bào ung thư ở người: - Hep - 2: Tế bào ung thư gan người.
2A.2.2. Tiến hành.
* Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn và được thử test với
các chất thử đã được chuẩn bị sẳn ở các nồng độ khác nhau trên phiến kính vi
lượng 96 giếng, trong dung môi DMSO 10%
* Mẫu thử nghiệm (bao gồm tế bào + môi trường nuôi cấy + chất thử) được ủ ở37°c để tế bào phát triển. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Sau 72 giờ lấy tế bào ra, cố định, rửa, nhuộm và hoà lại bằng dung dịch chuẩn.
Đọc kết quả trên máy Elisa ở bước sóng 495 — 515 nm. Nồng độ ức chế tế bào ung thư của chất thử được tính bằng đại lượng IC50.
* Đọc kết quả và biện luận.
Giá trị IC50 được tính trên chương trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị ED (liều lượng tác dụng) đo được, các mẫu có giá trị IC50 khác nhau.
Các mẫu tinh khiết có giá trị IC50 < 5 |ig/ml được coi là có hoạt tính.
* Lưu ý: Song song làm phiếu đối chứng OD (ngày O) để đối chứng cho lượng tế bào ở thời điểm bắt đầu thí nghiệm.
Về đối chứng âm: Giá trị OD của DMSO 10% để làm đối chứng cho giá trị của lượng tế bào khi kết thúc thí nghiệm. Cách cố định và nhuộm như với các mẫu thử.
* Dựa trên kết quả đo được của chứng OD (ngày O) và OD của DMSO 10% so sánh với giá trị OD khi trên mẫu chất thử để tìm giá trị ED50 theo công thức.
Mẫu có giá trị ED < 50% là mẫu có hoạt tính, dùng giá trị ED50 của 10 thang nồng độ dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.
LnY = a + bX
Y: Nồng độ chất thử. X: Giá trị ED50.
chất tổng hợp được trên 2 dòng tế bào ung thư. Kết quả trình bày ở bảng 10.
Bảng 10. Kết quả thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của các chất thử (IV, V).
Chất CTCT
Dòng tê bào - giá trị IC50
(|Ag/ml) K ết luận H e p -2 FL IV 02N-h(^)-CH=N-N/ ~ 1 > 5 >5 âm tính V CI-h(^^-CH=N-N/ ~ 1 2,93 >5 Dương tính 1 dòng ♦> Nhận xét.
Kết quả thử nghiệm cho thấy chất IV không có tác dụng chống ung thư. Chất V ở nồng độ IC50=2,93 |ag/ml có tác dụng kháng dòng tế bào ung thư gan người (Hep - 2), còn không tác kháng ung thư trên dòng tế bào ung thư màng tử cung (FL).
Có thể nhận xét rằng nguyên tử clo thế ở vị trí para của hợp phần aldehyd đã góp phần mang lại hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư Hep - 2 của chất V.
PHÂN 4.
KẾT LUẬN VÀ DỀ ÃUẤT.
Từ những kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Chúng tôi đã tổng hợp được 9 chất bao gồm 4- amino- 4H-1,2,4- triazol (I) và 8 dẫn chất azomethin (II — IX), trong đó chất V chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo được.
2. Trong quá trình tổng hợp các dẫn chất azomethin đã tiến hành theo dõi phản ứng bằng SKLM để xác định thời gian phản ứng tối ưu cho mổi phản ứng.
3. Đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy. Xác định cấu trúc của các chất bằng phân tích quang phổ hồng ngoại, tử ngoại và phổ khối lượng. Kết quả cho phép chúng tôi sơ bộ kết luận rằng các chất tổng hợp được có công thức đúng như dự kiến.
4. Đã thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 6 chất: I, II, IV, V, VI, IX bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch với 8 chủng vi khuẩn, 2 chủng vi nấm. Kết quả cho thấy chất IX có tác dụng mạnh trên hầu hết các vi sinh vật kiểm định. Chất II và chất V có tác dụng yếu trên một số vi khuẩn và không có tác dụng kháng nấm. Còn các chất khác không có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm.
5. Đã thử tác dụng kháng tế bào ung thư của 2 chất (IV,V) đối với 2 dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư gan người (Hep - 2) và tế bào ung thư màng tử cung (FL). Kết quả cho thấy chất V có tác dụng dương tính trên dòng tế bào Hep — 2, còn chất IV không có tác dụng.
* Với các kết quả đã đạt được, chúng tôi hy vọng đề tài này là một đóng góp nhỏ vào việc nghiên cứu, tìm hiểu các dẫn chất 4- amino- 4H- 1,2,4- triazol có hoạt tính sinh học.
Chúng tôi cho rằng cần tiếp tục thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất chưa thử và nghiên cứu sâu hơn tác dụng chống ung thư của chất V.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Berker.H, Berger.v, Thực hành hoá hữu cơ, NXB khoa học kỹ thuật,
tr.13 — 14. (Đọc theo bản dịch của Phan Tống Sơn, Lê Đăng Doanh, 1977). [2]. Bộ môn hoá dược (2003), Hoá dược, Đại học Dược Hà Nội, tập 2, tr.275 — 280; 296 — 297. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[3]. Bộ môn hoá hữu cơ (1990), Hoá hữu cơ, Đại học Dược Hà Nội, tập 1,