L ỜI CẢM ƠN
3.5. Phương tiện thí nghiệm
3.5.1. Đối tượng khảo sát
Phân heo được lấy mẫu ngẫu nhiên tại xã Thành Thới B, huyện Mỏ Cày, tỉnh Bến Tre, phân heo được chia và kiểm tra theo lứa tuổi:
- Heo con theo mẹ (7-28 ngày) - Heo con cai sữa (29-56 ngày) - Heo thịt (57-112 ngày)
- Heo nái sinh sản: nái mang thai Giống heo
- Heo nái: Landrace, Yorkshire x Landrace, Landrace x Duroc. - Heo thịt: Landrace x Duroc, Yorkshire x Landrace.
Có 2 kiểu chuồng nuôi: - Nuôi trên sàn - Nuôi trên nền xi măng Phương thức chăn nuôi: - Nuôi trang trại - Nuôi trại gia đình
Heo được lấy mẫu một lần theo phương thức điều tra cắt ngang.
Ước lượng mẫu điều tra
Dựa vào công thức tính số mẫu khảo sát là N = (1,96)2.q.p/d2, với: + p là tỷ lệ thăm dò.
+ q = 1 – p.
+ d là độ chính xác mong muốn (0,05) giữa tỷ lệđạt được và tỷ lệ thăm dò. (Dựa theo Canon và Poe, 1982 và dẫn liệu của Thrusfield, 1995).
24
Qua khảo sát tham dò trên 87 mẫu phân ở 4 lứa tuổi trên tại xã Thành Thới B, huyện Mỏ Cày Nam, tỉnh Bến Tre, cho thấy tỷ lệ nhiễm noãn nang cầu trùng là 29,07%. Số mẫu phân kiểm tra ởđộ tin cậy 95% là 317 mẫu. Như vậy số lượng mẫu khảo sát ở các địa điểm trên địa bàn xã Thành Thới B, nhiều hơn số mẫu ước lượng, được thể hiện qua bảng 1. Bảng 2: Phân bố lấy mẫu tại địa bàn xã Thành Thới B Địa điểm Số mẫu khảo sát toàn xã Lứa tuổi Heo con
theo mẹ Heo cai sữa Heo thịt Nái sinh sản
Trại A 176 26 50 50 50
Trại B 79 4 25 25 25
Trại gia đình 159 29 58 49 23
Tổng 414 59 133 124 98
3.5.2. Cách lấy mẫu
- Mẫu phân được kiểm tra phải mới, lấy ở từng cụm dọc theo dãy chuồng, lấy bao quát khắp chuồng, đảm bảo tính ngẫu nhiên.
- Thu thập mẫu cho vào túi nylon cột lại và ghi lại thông tin của từng mẫu (địa điểm, lứa tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng phân, phương thức chăn nuôi). - Mẫu vừa lấy xong phải được bảo quản trong thùng có đá khô, dán kín và
mang về phòng thí nghiệm để tiến hành kiểm tra.
Mẫu phân được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 5-100C và tiến hành kiểm tra trong vòng 2-3 ngày.
3.5.3. Vật liệu thí nghiệm
Mẫu: Phân heo lấy tại xã Thành Thới B, huyện Mỏ Cày Nam, tỉnh Bến Tre.
Dụng cụ:
Kính hiển vi, thước trắc vi thị kính, phiến kính (lame) và lá kính (lamelle), đĩa petri, ống nhỏ giọt, lọ penicillin, đũa thủy tinh, kẹp, bi sắt, buồng đếm Mc Master, cốc 50ml, 200ml, ống đong 50ml, rây lược 81 lỗ/cm2, ống nghiệm có nắp, máy ly tâm
Hóa chất:
Dung dịch NaCl bão hòa (gồm: NaCl tinh thể 450g; nước cất 1000ml) Dung dịch Kali Bicromate 2,5%
25
Hình 9. Một số dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 3.6. Phương pháp thí nghiệm
3.6.1. Phương pháp phù nổi (Willis)
Nguyên lý: Dựa trên sự chênh lệch về tỷ trọng. Dùng dung dịch NaCl bão hòa có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng của noãn nang cầu trùng làm noãn nang nổi lên trên bề mặt của dung dịch.
Mục đích: Xác định sự hiện diện của noãn nang cầu trùng trong phân. Tính tỷ lệ nhiễm:
Tỷ lệ nhiễm (%) = Số mẫu nhiễm
Số mẫu kiểm tra× 100
Cách tiến hành:
- Lấy khoảng 3g phân cho vào lọ penicillin sạch. - Cho dung dịch phù nổi NaCl bão hòa vào đến 1/2 lọ.
- Dùng đũa hòa tan phân trong lọ (mỗi mẫu dùng một đũa khuấy riêng để tránh noãn nang từ mẫu này lẩn sang mẫu khác).
- Cho dung dịch phù nổi vào tiếp đến gần đầy lọ và gắp bỏ hết phân còn lại nổi trên bề mặt dung dịch.
- Cho tiếp dung dịch đến đầy lọ (tránh cho tràn dung dịch ra ngoài).
- Đậy lá kính lên trên miệng lọ (đảm bảo không có bọt khí) và để yên khoảng 25-30 phút.
- Giở thẳng lá kính lên, đặt trên phiến kính (đảm bảo không có bọt khí) rồi quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X10 để tìm noãn nang cầu trùng.
26
Hình 10: Thực hiện tiêu bản phù nổi 3.6.2. Phương pháp Mc Master
Mục đích: xác định cường độ nhiễm cầu trùng, bằng cách đếm số lượng noãn nang trong 1 gram phân bằng buồng đếm Mc Master, đánh giá hiệu quả sử dụng thuốc để tẩy trừ.
Cách tiến hành:
- Cho 42ml dung dịch NaCl bão hòa vào ống đong thủy tinh - Cho mẫu phân vào đến vạch 45ml (tương đương 3gram phân)
- Sau đó cho 20 viên bi sắt vào lắc cho phân được tán đều trong dung dịch - Dùng pipet hút dung dịch cho vào 2 buồng đếm Mc Master, để yên 5-10
phút rồi đếm số noãn nang quan sát được trong 2 buồng đếm.
- Đặt buồng đếm lên kính hiển vi xem ở vật kính X10, và đếm số lượng noãn nang cầu trùng có trong 2 buồng đếm.
Tính giá trị trung bình
Gọi N là số noãn nang trung bình:
N =Số noãn nang trên buồng đếm 1 + số noãn nang trên buồng đếm 2 2
Cách tính:
Thể tích mỗi buồng đếm là 0,15ml
0,15ml của 3 gram phân trong dung dịch 45ml - Số noãn nang trong tổng số 45ml = ∗
,"
- Vậy số noãn nang có trong 1 gram phân X = ∗
," ∗#=N*100
- Cường độ nhiễm: Sau khi tính số noãn nang có trong 1 gram phân, chúng tôi chia thành các mức độ nhiễm sau:
Nhiễm cường độ 1 (+): >50-5000 noãn nang/1 gram phân Nhiễm cường độ 2 (++): >5000-10000 noãn nang/1 gram phân Nhiễm cường độ 3 (+++): >10000 noãn nang/1gram phân
27
Hình 11: Phương pháp Mc Master kiểm tra cường độ nhiễm ở X10 3.6.3. Phương pháp nuôi cấy noãn nang
Mục đích: Theo sự phát triển của noãn nang cầu trùng trong môi trường Bichromate Kali 2,5%, xác định thời gian sinh bào tử của noãn nang để bổ sung cho nghiên cứu định danh loài cầu trùng ký sinh trên heo.
Cách tiến hành:
- Mẫu phân sau khi kiểm tra và xác nhận cường độ nhiễm cao, mẫu phân này được sử dụng thực hiện nuôi cấy.
- Lấy 3 gram phân cho vào 50ml nước cất, dùng que khuấy đều. - Lược qua rây 81 ô/cm2, bỏ cặn.
- Dung dịch sau lọc cho vào cốc 500ml, thêm nước đến vạch 500ml, để yên 5- 10 phút (cho noãn nang lắng xuống đáy).
- Bỏ phần nước trong, phần cặn cho vào ống nghiệm đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút, trong 5 phút.
- Lấy ra đổ bỏ phần nước trong chỉ giữ lại phần cặn trong ống nghiệm, ở trong cặn này mật độ noãn nang rất cao.
- Cho vào đĩa Petri phần cặn của ống nghiệm và dung dịch Bichromate Kali 2,5% theo tỉ lệ 1:1 (một phần dung dịch chứa noãn nang, một phần dung dịch Bichromate Kali 2,5%) để yên ở nhiệt độ phòng.
- Sau 12 giờ nuôi cấy, cứ 2 giờ kiểm tra và quan sát dưới kính hiển vi 1 lần ghi nhận thời gian sinh bào tử.
Mỗi ngày kiểm tra sự phát triển và hình thành bào tử của noãn nang cầu trùng, theo dõi thời gian hình thành bào tử của noãn nang. Thời gian sinh bào tử của các loại noãn nang cầu trùng từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 13.
28
Hình 12: Phương pháp nuôi cấy noãn nang xác định thời gian sinh bào tử 3.6.4. Phương pháp định danh phân loại
Tiến hành định danh phân loại theo khóa phân loại của Eckert (1995), dựa vào đặc điểm như sau:
- Đặc điểm hình thái cấu tạo: đặc điểm vỏ, màu sắc của noãn nang, hình dáng của noãn nang được thực hiện qua phương pháp phù nổi của Willis và được xem qua kính hiển vi X10 (phóng đại 100 lần) và X40 (phóng đại 400 lần). - Thời gian hình thành bào tử: sau khi mẫu phân nhiễm noãn nang cầu trùng
đã được nuôi cấy, cứ 2 giờ tiến hành kiểm tra một lần để xác định được thời gian hình thành bào tử của từng loại cầu trùng.
- Đo kích thước các loại noãn nang: trên mỗi loài tiến hành đo kích thước khoảng 30 noãn nang để tìm số vạch đo của chiều dài và chiều rộng được thực hiện trên thước trắc vi thị kính. Số vạch đo đếm được sẽđược nhân với 2,5, các số liệu thu được sẽ tương ứng với chiều dài và rộng của noãn nang (đơn vị µm).
Ghi nhận lại toàn bộ kết quả thu được sau đó so sánh với số liệu trên lý thuyết, phục vụ cho công tác định danh phân loài.
3.7. Phương pháp xử lý số liệu
So sánh tỷ lệ nhiễm: dùng phép thử Chi-Square (χ2 ).
29
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Qua kiểm tra 414 mẫu phân tại xã Thành Thới B, huyện Mỏ Cày Nam, tỉnh Bến Tre, kết quả về tình hình nhiễm cầu trùng heo tại xã Thành Thới B như sau:
4.1. Tình hình nhiễm cầu trùng trên heo theo phương thức chăn nuôi tại xã Thành Thới B Thành Thới B
Bảng 3. Kết quả tình hình nhiễm cầu trùng trên heo tại xã Thành Thới B Địa điểm SMKT SMN TLN (%) Cường độ nhiễm 1(+) 2(+) 3(+) SMN TLN (%) SMN TLN (%) SMN TLN (%) Trại heo A 176 42 23,86 a 42 100,00 _ _ _ _ Trại heo B 79 18 22,78 a 15 83,33 _ _ 3 16,67 Trại hộ gia đình 159 68 42,77 b 51 75,00 7 10,29 10 14,71 Tổng 414 128 30,92 108 84,38 7 5,47 13 10,16 Chú thích: SMKT: Số mẫu kiểm tra SMN: Số mẫu nhiễm TLN: Tỷ lệ nhiễm
a,b: 2 chữ cái trên cùng một cột khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê
Qua khảo sát 414 mẫu phân ở 3 địa điểm thuộc xã Thành Thới B là: Trại A, trại B và trại gia đình. Kết quả được thể hiện qua bảng 2, có 128 mẫu phân nhiễm cầu trùng heo với tỷ lệ là 30,92%. Trong đó trại hộ gia đình nhiễm khá cao 42,77%, kế đến là trại A 23,86% và thấp nhất là trại B 22,78%. Tỷ lệ nhiễm cầu trùng trên heo tại trại A, trại B và trại hộ gia đình khác biệt có ý nghĩa thống kê (P=0,013), kết quả phù hợp với Hoàng Thế Huy (2007). Nguyên nhân chủ yếu của sự khác biệt này là do ở trang trại có điều kiện chăn nuôi khá tốt, nhà chăn nuôi có trình độ chuyên môn, quy trình chăm sóc nuôi dưỡng, sát trùng, vệ sinh chuồng trại và công tác thú y được thực hiện nghiêm ngặt vì vậy đàn heo được nuôi ở 2 trại này tỷ lệ nhiễm thấp hơn. Trong khi đó ở trại hộ gia đình có tỷ lệ nhiễm cao hơn do khâu vệ sinh chuồng trại kém, quy trình phòng bệnh còn chưa được thực hiện tốt, tạo điều kiện cho cầu trùng phát triển.
Nhìn chung ở cả 3 địa điểm khảo sát đều nhiễm cầu trùng với cường độ nhiễm 1(+) cao chiếm tỷ lệ 84,38%, kếđến là cường độ nhiễm 3(+) là 10,16%, thấp nhất là cường độ nhiễm 2(+) là 5,47%.
30
4.2. Tình hình nhiễm cầu trùng trên heo giữa các kiểu chuồng tại xã Thành Thới B Thới B
Bảng 4. Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng trên heo giữa các kiểu nền chuồng Loại nền chuồng Tình hình nhiễm cầu trùng Cường độ nhiễm SMKT SMN TLN (%) 1(+) 2(+) 3(+) SMN TLN (%) SMN TLN (%) SMN TLN (%) Nền sàn 63 7 11,11a 7 100,00 − − − − Nền xi măng 351 121 34,47b 101 83,47 7 5,79 13 10,74 Tổng 414 128 30,92 108 84,38 7 5,47 13 10,16 Chú thích: SMKT: Số mẫu kiểm tra SMN: Số mẫu nhiễm TLN: Tỷ lệ nhiễm
a,b: 2 chữ cái trên cùng một cột khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê
Qua bảng 4 cho thấy heo được nuôi ở 2 kiểu chuồng sàn và nền xi măng thì tỷ lệ nhiễm cũng có sự khác biệt. Với kiểu nền sàn heo nhiễm cầu trùng chiếm tỷ lệ 11,11% thấp hơn so với heo được nuôi trên nền xi măng 34,47%. Sau khi phân tích thống kê chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt giữa 2 kiểu nền chuồng ở mức có ý nghĩ thống kê với độ tin cậy 95% (P=0,002). Có sự khác biệt này là do: nuôi kiểu nền sàn rất dễ làm vệ sinh chuồng trại, phân thải ra được thu dọn ngay không bị tồn đọng phân và nước bẩn, chuồng lúc nào cũng khô ráo, thông thoáng, hạn chế mầm bệnh phát triển còn nuôi trên nền xi măng chuồng thường ẩm ướt, phân và nước bẩn tồn đọng lại lâu trong chuồng nuôi tạo điều kiện cho noãn nang cầu trùng cũng như các mầm bệnh khác phát triển.
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hoàng Thế Huy (2007), heo ở tỉnh Trà Vinh được nuôi theo kiểu nền sàn nhiễm cầu trùng chiếm tỷ lệ 45,18% thấp hơn so với heo được nuôi trên nền xi măng 69,30%.
Nhìn chung ở cả 2 loại nền chuồng được khảo sát đều nhiễm cầu trùng với cường độ nhiễm 1(+) cao chiếm tỷ lệ 84,38%, trong đó heo được nuôi trên nền sàn bị nhiễm cầu trùng chỉ ở mức 1(+). Heo được nuôi trên nền xi măng phát hiện heo nhiễm ở cường độ 2(+) và 3(+) với tỷ lệ lần lượt là 5,79% và 10,74%.
31
4.3. Tình hình nhiễm cầu trùng trên heo theo lứa tuổi tại xã Thành Thới B Bảng 5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng trên heo giữa các lứa tuổi Bảng 5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng trên heo giữa các lứa tuổi
Lứa tuổi SMK T SMN TLN (%) Cường độ nhiễm 1(+) 2(+) 3(+) SMN TLN (%) SMN TLN (%) SMN TLN (%) Heo theo mẹ 59 11 18,64a 10 90,91 1 9,09 − − Heo cai sữa 133 43 32,33ab 34 79,07 2 4,65 7 16,28 Heo thịt 124 42 33,87b 34 80,95 2 4,76 6 14,29 Nái sinh sản 98 32 32,65ab 29 90,63 2 6,25 1 3,13 Tổng 414 128 30,92 107 83,59 7 5,47 14 10,94 Chú thích: SMKT: Số mẫu kiểm tra SMN: Số mẫu nhiễm TLN: Tỷ lệ nhiễm
a,b: 2 chữ cái trên cùng một cột khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê
Qua bảng 5 cho thấy heo ở 4 lứa tuổi thì đều nhiễm cầu trùng. Heo thịt nhiễm cầu trùng với tỷ lệ cao nhất 33,87%, heo nái là 32,6%, kếđến là heo cai sữa với tỷ lệ 32,33%, thấp nhất là heo con theo mẹ 18,64%. Sau khi phân tích thống kê chúng tôi nhận thấy sự khác biệt giữa heo con theo mẹ và heo thịt có ý nghĩa thống kê (P=0,034). Điều này được giải thích như sau:
Heo con theo mẹ nhiễm cầu trùng với tỷ lệ thấp do heo con trước cai sữa có miễn dịch thụ động được truyền từ sữa mẹ, heo ở lứa tuổi này được chăm sóc rất tốt, môi trường chuồng nuôi được giữ sạch sẽ, bên cạnh đó heo con sau khi sinh 3 ngày tuổi tại các trang trại sẽđược tẩy trừ cầu trùng nên khả năng nhiễm bệnh thấp, chủ yếu nhiễm ở cường độ 1(+).
Đối với heo thịt, phần lớn heo không được tẩy trừ cầu trùng, không có miễn dịch thụ động. Heo thịt và heo nái có tỷ lệ nhiễm cầu trùng cao, tuy nhiên cường độ nhiễm thấp ở mức 1(+). Chính vì vậy, bệnh không gây tiêu chảy trên heo thịt và heo nái. Tuy nhiên, quá trình bài thải ra noãn nang cầu trùng ra ngoài môi trường vẫn luôn tiếp tục. Đó là nguồn tiềm ẩn phát tán và lây lan mầm bệnh cho gia súc khỏe.
Qua bảng 5 cho thấy heo ở cả 4 lứa tuổi heo con theo mẹ, heo cai sữa, heo thịt, heo nái đều nhiễm cầu trùng ở mức độ 1(+) và 2(+) nhưng chủ yếu nhất là ở mức 1(+). Ở heo con theo mẹ, heo nuôi trên nền sàn khô ráo sạch sẽ, được chăm sóc nuôi dưỡng tốt, có quy trình tẩy trừ bệnh ở 3 ngày tuổi nên tỷ lệ nhiễm bệnh không cao chủ yếu chỉ ở mức 1(+). Heo con cai sữa, heo thịt và heo nái có nhiễm ở mức 2(+) và 3(+). Đặc biệt là heo con cai sữa nhiễm nặng ở mức 3(+) (16,28%), cao hơn heo thịt (14,29%) và heo nái (3,13%). Điều này cho thấy heo con cai sữa có thể dẫn đến bệnh cầu trùng. Ở mức độ nhiễm 3(+), heo thường có triệu chứng tiêu chảy, phân có màu vàng kem đến vàng sậm, đôi khi xám. Cầu trùng làm heo giảm hấp thu
32
chất dinh dưỡng, heo còi cọc chậm lớn, làm giảm sức đề kháng, tạo điều kiện cho các bệnh khác xâm nhập. Cường độ nhiễm cao có thể được giải thích là do 2 yếu tố chính: suy giảm miễn dịch thụđộng được truyền từ mẹ sang con và yếu tố stress do heo con cai sữa phải tập làm quen với môi trường, thức ăn mới. Điều này phù hợp