M Ở ĐẦU
2.3.Phương pháp nghiên cứu
b. Ứng dụng của chất chống oxi hóa
2.3.Phương pháp nghiên cứu
a) Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret
Nguyên lý: trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu++ thành một phức chất màu tím (phản ứng biuret), màu sắc của phức chất tỷ lệ với số liên kết peptid (- CO – NH) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương ứng giữa albumin và globulin. Sự tạo phức xảy ra như hình 2.1[4]
Hình 2.5 Công thức tạo phức khi cho thuốc thử biuret vào protein Tiến hành:
Dịch sau khi thủy phân cần kiểm tra hàm lượng protein: cho 1ml dịch vào ống nghiệm, cho thêm 4ml thuốc thử Biuret vào lắc đều và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ mang các mẩu so màu trên máy đo OD ở bước sóng 570nm. Đọc giá trị mật độ quang học rồi dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng protein trong mẫu.
Kết quả: dựa vào kết quả đường chuẩn và giá trị mật đọ quang học thu hồi để
xác định hàm lượng protein có trong dịch thủy phân.
Dựng đường chuẩn BSA:
Thuốc thử biuret: hòa tan 1,18gam CuSO4.5H2O và 4,03gam C4H4NaKO6.H2O trong 250ml nước cất, khuấy đều. Cho thêm 150ml NaOH 10% rồi định mức toàn bộ dung dịch lên 500ml bằng nước cất.
Pha dung dịch chuẩn BSA : hòa tan 1g BSA trong 50ml nước cất rồi khuấy đều đến khi BSA tan hết rồi định mức lên 100ml bằng nước cất (hàm lượng BSA: 10mg/ml)
Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 0 – 5 sau đó cho các dung dịch hóa chất vào ống nghiệm với thể tích và thứ tự như sau:
Bảng 2.5 Thể tích các dung dịch hóa chất cho vào các ống nghiệm
Ống nghiệm Dung dịch hóa chất 0 1 2 3 4 5 BSA chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Nước cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Thuốc thử Biuret(ml) 4 4 4 4 4 4 Hàm lượng BSA (mg/ml) 0 2 4 6 8 10
- Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút .
- Sau khi ủ, dung dịch trong các ống nghiệm trên được đo mật độ quang học ở bước sóng 570nm, để đo giá trị OD570 ( sử dụng ống 0 làm mẫu blank).
b) Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch thu được bằng test kiểm soát
khả năng khử gốc tự do DPPH (2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl) theo phương
pháp của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Yoshihiro Ochiai, Toshiaki Ohshima(2010) [11].
Nguyên lý: dựa vào độ mất màu của gốc tự do DPPH khi có mặt dịch thủy phân. DPPH là gốc khử, có bản chất dể bị oxi hóa, có màu tím đậm, khi có mặt chất chống oxi hóa, gốc tự do DPPH sẽ nhận điện tử chuyển thành phân tử DPPH và mất màu tím. Như vậy, chất có hoạt tính chống oxi hoá càng mạnh sẽ càng làm mất màu dung dịch gốc tự do DPPH càng mạnh.
Tiến hành thí nghiệm như sau:
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa các mẫu như sau: - Mẩu thử đối chứng : 2ml nước cất
1ml C2H5OH 96%
1ml dung dịch DPPH 1 mM - Mẩu blank: 0,2ml dịch mẩu thủy phân
1,8ml H2O
2ml C2H5OH 96%
- Mẩu kiểm tra: 0,2ml dịch mẩu thủy phân 1,8ml H2O
1ml C2H5OH 96%
1ml dung dịch DPPH 1 mM
Sau khi chuẩn bị xong, ủ mẫu 30 phút trong bóng tối sau đó đo OD ở bước sóng 517nm.
* Dựng đường chuẩn DPPH
- Chuẩn bị dung dịch DPPH: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1mM: cân 0,0394g DPPH định mức bằng ethanol 96% thành 100ml. Khi hòa tan DPPH bằng ethanol phải tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng.
- Chuẩn bị 5 ống nghiệm sạch, đánh số từ 0-5. Tiếp theo cho dung dịch hóa chất vào theo bảng sau:
Bảng 2.6 Thể tích của các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm
Ống nghiệm DDPH (ml) Nước cất (ml) Ethanol (ml) Hàm lượng (Mm) 1 1 2 1 0.1 2 0.8 2.2 1 0.02 3 0.6 2.4 1 0.04 4 0.4 2.6 1 0.06 5 0.2 2.8 1 0.08 0 0 4 0 0
- Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau đó tiến hành so màu ở bước sóng 517nm (sử dụng ống 0 làm mẫu blank).
c) Phân tích tổng năng lực khử của dịch protein
Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein được phân tích dựa vào phương pháp của Oyaizu [16]. Cách tiến hành như sau:
Cho vào ống nghiệm 0,05 ml dịch thủy phân protein đã ly tâm. Sau đó cho 0,5ml K3[Fe(CN)6] 1% vào ống nghiệm và cho dung dịch đệm phosphat để đủ 1,5ml, lắc đều rồi đem đi ủ trong tủ ấm ở 500C trong 20 phút. Lấy ra cho 0,5ml tricloacetic 0,1%, 2ml nước cất vào và cuối cùng cho 0,4ml FeCl3 0,1% rồi lắc đều và đem đi đo ở bước sóng 700nm trên máy quang phổ kế.
Mẫu trắng để đối chứng được chuẩn bị như sau: Cho vào ống nghiệm 0,05ml nước cất,0,5ml K3[Fe(CN)6] 1%, 0,95ml dung dịch đệm phosphat, lắc đều rồi đem đi ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 500C trong 20 phút. Lấy ra cho 0,5ml tricloacetic 1%, 2ml nước cất và cuối cùng cho 0,4ml FeCl3 0,1% rồi lắc đều và đem đi đo ở bước sóng 700nm trên máy quang phổ kế.
Đánh giá tổng năng lực khử qua độ hấp thụ ở bước sóng 700nm trên máy quang phổ kế.
d) Xác định hàm lượng protein tổng số theo theo TCVN 3705 – 1990.
e) Xác định hàm lượng acid amin tổng số theo TCVN 3708 – 1990.
f) Xác định hàm lượng acid amin tự do theo phương pháp GS – MS.
g) Xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C theo TCVN
3700 – 1990.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý trên phần mềm Excel, Minitab và DX8.01 với độ tin cậy 95%.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN