L ỜI CẢM Ơ N
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.2.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KÝ SINH TRÙNG
Dựa theo phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng của viện sỹ V.A. Dogiel ựược bổ sung của TS. Hà Ký và TS. Bùi Quang Tề, 2007.
2.2.1.1. Các dụng cụ thiết bị và hóa chất ựể giải phẫu và nghiên cứu ký sinh trùng cá
* Dụng cụ thiết bị:
- Kắnh lúp; kắnh giải phẫu (kắnh soi nổi), thị kắnh: x7, x10, vật kắnh: x2, x4, x10; kắnh hiển vi, thị kắnh: x7, x10, x15, vật kắnh: x10, x20, x40, x100.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ19 - Bộ ựồ giải phẫu gồm các dụng cụ sau: dao liền cán cỡ vừa ựể cạo nhớt, dao cán dời ựể rạch cơ, pinxet các loại (loại có răng và loại thẳng), dùi nhọn giải phẫu (cán gỗ hoặc cán sắt), kéo các loại, các cỡ (mũi nhọn, mũi bằng, mũi cong).
- Ống hút các loại (kể cả những loại rất bé ựể hút KST kắch thước nhỏ như sán lá ựơn chủ).
- Ngoài ra cần các loại ựồ ựựng khác như: khay men, ựĩa petri, cốc thuỷ tinh nhỏ, ống thuỷ tinh nhỏ, ựĩa mặt ựồng hồ, chén thuỷ tinh nhỏ...
* Hoá chất: cồn 500, 700, 900 , 960, 1000, xylen, nhựa Canada, formol 4%, 10%, hematocylin, fericsulfat amonium 3%, 1,5%, Gelatin - glycerin, pepsin, HCl, NaCl, NH4OH...
2.2.1.2. Kỹ thuật giải phẫu cá
Hình 2.1: Giải phẫu cá A- sơựồựường cắt; B, C - các cơ quan nội tạng
1- bóng hơi; 2- ống khắ; 3- tim; 4- lách; 5- gan; 6- ruột; 7- thận; 8- hậu môn ; 9- túi nước tiểu; 10- tuyến sinh dục; 11- mang.
Tay trái cầm cá giữ hơi ngửa bụng lên trên, dùng kéo nhọn chọc nhẹ vào da bụng mềm ở lỗ hậu môn cắt một ựường ngang vừa phải về phắa vây ngực, cắt tiếp
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ20 ựường dọc theo ựường bên tới phần dưới mang, sau ựó cắt ựường thứ 3 giao với hai ựường cắt trước. Lấy hẳn cả miếng cắt ra ngoài, sẽ thấy rõ các cơ quan nội tạng. Cần chú ý thận trọng khi ựưa kéo cắt, tránh làm thủng các cơ quan bên trong.
2.2.1.3. Nghiên cứu bên ngoài và thu mẫu ngoại ký sinh trùng
Xem xét bên ngoài cá, nên ựể trong khay một ắt nước. Cần xem xét kỹ vẩy, da có thể phát hiện các loại ký sinh trùng bám. Sau ựó cắt các vây cho lên kắnh, thêm ắt nước rồi quan sát dưới kắnh giải phẫu.
Cạo nhớt ở các phần khác nhau trên thân cá, quan sát dưới kắnh hiển vi có thể phát hiện Monogenea và trùng ựơn bào, những ký sinh trùng thường gây nguy hiểm cho cá.
Nghiên cứu ký sinh trùng ở mang cá: dùng kéo cắt nắp mang, cắt các cung
mang và lấy các lá mang. Dùng dùi giải phẫu xem xét kỹ các tơ mang dưới kắnh giải phẫu sau khi ựã cho thêm mấy giọt nước.
2.2.1.4. Nghiên cứu ruột và thu ký sinh trùng
Ruột có thể ựược nghiên cứu từ sau ựến trước hoặc ngược lại. Cắt ruột thành từng ựoạn, mổ dọc ra ựể quan sát. Những ký sinh trùng có thể thấy bằng mắt thường thì dùng dùi nhọn lấy ra cho vào nước lạnh hoặc nước muối sinh lý. Lấy nội chất ép giữa hai tấm kắnh ựể quan sát dưới kắnh giải phẫu. Cạo nhớt trong thành ruột ựể nghiên cứu, ép thành ruột quan sát dưới kắnh giải phẫu. Nghiên cứu ký sinh trùng ựơn bào trong ruột trước, giữa, sau bằng phương pháp phết kắnh.
2.2.1.5. định hình, bảo quản và làm tiêu bản ký sinh trùng
- Cốựịnh và bảo quản mẫu
đối với ký sinh trùng ựơn bào cố ựịnh mẫu bằng cách phết kắnh: dùng lamen ựặt lên trên lam kắnh ở vị trắ có mẫu, kéo ngược lamen về phắa sau sao cho nhớt có thể dàn ựều một lớp mỏng ựể khô tự nhiên trong không khắ, xếp mẫu trong
các hộp có lót lớp giấy ựể bảo quản. Với những mẫu cố ựịnh bằng cách này cần
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ21
không khắ nhúng vào dung dịch shaudin ấm từ 10-15 phút, sau ựó rửa qua cồn 700
cho qua dung dịch iốt loãng trong vòng 15 ựến 20 phút, rửa lại bằng cồn iốt, sau ựó bảo quản trong cồn 700
Ký sinh trùng thuộc lớp sán lá: ựịnh hình bằng cách ựè ép giữa hai phiến kắnh, rót cồn 700 vào giữa hai phiến kắnh, giữ sán ở trạng thái ựó trong thời gian từ 5-10 phút tuỳ theo kắch thước và ựộ dày của sán, có thể sử dụng nước nóng ựể làm cho sán không hoạt ựộng, sau ựó dùng cồn ựể cố ựịnh. Ngoài ra có thể dùng formol 4% hoặc 10% ựể cố ựịnh. Bảo quản trong cồn hoặc formol. đối với sán lá ựơn chủ có thể dùng amoniac 1% ựể cố ựịnh và làm rõ các móc bám.
Sau ựó nhuộm màu và làm tiêu bản ký sinh trùng. Tuỳ theo từng loại ký sinh trùng khác nhau mà có các phương pháp nhuộm khác nhau.
- Nhuộm màu và làm tiêu bản
- Ký sinh trùng ựơn bào như trùng lông, trùng bào tử sợi, trùng amắp, cầu trùng, vi bào tử có thể nhuộm theo 2 cách: nhuộm bạc nitơrat 2% hoặc nhuộm bằng hematoxylin.
+ Dùng bạc nitơrat 2%: các lamen có mẫu ựã giữ khô, xếp vào ựĩa peptri mặt có trùng ngửa lên trên. Dùng pipet nhỏ dung dịch AgNO3 2% lên chỗ phết mẫu, ựậy nắp ựĩa peptri ựể tất cả vào buồng tối trong thời gian từ 10-15 phút, lấy ra rửa qua nước cất 3-4 lần, tất cả các kắnh sau khi rửa chuyển sang ựĩa nước cất khác ựể mặt có trùng hướng lên trên, ựem phơi dưới ánh sáng mạnh của mặt trời trong thời gian từ 1-1,5 giờ, sau ựó phơi tiếp trong ánh sáng ựèn thạch anh thuỷ ngân trong vòng 20-30 phút. Trong quá trình phơi cần kiểm tra các mẫu phết kắnh trong 1/2 thời gian quy ựịnh, nếu quan sát thấy rõ các cơ quan của trùng thì ngừng phơi. Rửa lại mẫu trong nước cất, ựể khô tự nhiên trong không khắ, gắn tiêu bản bằng nhựa Canada và ghi etyket.
+ Nhuộm mẫu bằng Hematoxylin: lấy những mẫu ựã cố ựịnh trong cồn 700
ra rửa qua nước cất từ 2 - 3 phút, sau ựó cho mẫu vào dung dịch fericsulfat amonium 3% từ 12 - 24 giờ cho mẫu gắn chặt vào kắnh. Tiếp tục rửa qua nước cất 3 - 5 phút rồi cho vào thuốc nhuộm hematoxylin trong khoảng 12 giờ ựể nhuộm màu, sau ựó rửa qua vòi nước chảy. Kắnh phết nhuộm màu tốt sẽ có màu xanh lơ thẫm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ22 hoặc màu gần như ựen, cho phết kắnh nhuộm màu vào phân biệt trong dung dịch
fericsulfat amonium 1,5%. Kiểm tra dưới kắnh hiển vi cho ựến khi thấy rõ các cơ
quan của trùng, rửa trong nước cất 1 - 2 lần. Lần lượt cho qua các nồng ựộ cồn 500, 700, 900 , 960, 1000, xylen trong thời gian từ 3 - 5 phút. Gắn tiêu bản bằng nhựa Canada.
- Sán lá ựơn chủ: Có thể làm tiêu bản tươi bằng cách ựể trùng lên lam, nhỏ
dung dịch amoniac 1% ựể ựịnh hình, rút nước bằng giấy thấm, gắn tiêu bản bằng
Gelatin - glycerin hoặc nhựa Canada. Với những sán có kắch thước lớn nhuộm màu giống như với sán lá song chủ.
- đối với sán lá song chủ: Sán ựược lấy ra khỏi chất cố ựịnh, rửa trong nước cất cho ựến khi hết chất cố ựịnh, ựể trong nước từ 30 phút ựến 2 giờ, sau ựó cho sán ựã rửa vào dung dịch Carmin, thời gian nhuộm từ 10 - 60 phút tuỳ thuộc vào kắch thước của sán và ựộ dày của lớp vỏ. Sán ựã nhuộm tốt sẽ ựược rửa nước và rót cồn axit HCl vào, kiểm tra mức ựộ phân ly rõ của các cơ quan dưới kắnh hiển vi. Làm sạch cồn và lần lượt cho các mẫu ựã nhuộm qua các nồng ựộ 700, 800 ,900 và 960. để làm trong mẫu dùng xylen, gắn tiêu bản bằng nhựa Canada.
2.2.1.6. đo ựếm ký sinh trùng
Tắnh cường ựộ nhiễm:
+ Với ký sinh trùng có kắch thước nhỏ (trùng ựơn bào): mỗi lamen kiểm tra ựếm 15 thị trường trên kắnh hiển vi (ựộ phóng ựại x100 hoặc x40)
Tổng số trùng của 15 thị trường kiểm tra Cường ựộ nhiễm trung bình =
15 + Với sán lá: mỗi con cá kiểm tra ựếm ắt nhất 3-5 la men
Tổng số trùng trên các la men kiểm tra Cường ựộ nhiễm trung bình =
Số la men kiểm tra
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ23
+ Cường ựộ nhiễm: Min., Max. là số trùng ựếm ựược ắt nhất, nhiều nhất/1 ựơn vị
kiểm tra (thị trường 4x10 hoặc lamen hoặc cơ thể).
Tắnh tỷ lệ nhiễm:
Số cá nhiễm ký sinh trùng
- Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100
Số cá kiểm tra
đo kắch thước:
đối với ký sinh trùng nhỏ dùng thước ựo (Ocularis) micromet, ký sinh trùng lớn ựo bằng compa, giấy kẻ ly. đo các chỉ tiêu phân loại của từng loài ký sinh trùng theo yêu cầu. Số lượng ựo ắt nhất là 10-15 trùng, nếu gặp ắt, cần ựo toàn bộ số trùng bắt gặp.
Phân loại
Dựa vào hình thái, cấu tạo ký sinh trùng, quan sát trùng sống và trùng ựã cố ựịnh, nhuộm màu, vẽ và chụp ảnh. Từ ựó so sánh, phân loại theo các tài liệu phân loại ký sinh trùng ựã có.
Tài liệu phân loại:
Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam của Hà Ký và Bùi Quang Tề, 2007; Sán lá ựơn chủ (Monogenea) ở cá của Bưkhôpski, 1957;
Ký sinh trùng ựơn bào của Lom và Dykova, 1992;
Monogenea, Trematoda, Nematoda, Crustacea ký sinh ở cá của Yamaguti, 1958, 1960, 1963, 1971.
2.2.2. Phương pháp ựiều tra các bệnh có thể gặp gây nguy hiểm cho cá Hồng ựỏ
điều tra tiến hành theo 3 bước: Bước 1: điều tra dấu hiệu bệnh lý: Trạng thái hoạt ựộng của cá; Các ựiểm tổn thương trên cá; Giải phẫu nội tạng.
Bước 2: điều tra tác hại trên cá giống, cá thương phẩm Ký sinh trùng có gây chết cá hay không;
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ24 Có làm cá chậm lớn không.
Bước 3: điều tra về không gian phân bố của bệnh: bệnh xuất hiện trong ao nuôi bằng thức ăn tự chế hay ao nuôi bằng thức ăn công nghiệp.
2.3. Xử lý số liệu
Số liệu ựược xử lý bằng phần mềm excel
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thành phần giống, loài ký sinh trùng trên cá Hồng ựỏ nuôi thương phẩm tại Quảng Ninh phẩm tại Quảng Ninh
Chúng tôi tiến hành thu mẫu cá Hồng đỏ ựược nuôi tại Yên Hưng - Quảng
Ninh trong 3 ao nuôi bằng thức ăn công nghiệp, 3 ao nuôi bằng cá tạp, mỗi ao có
diện tắch 1.000m2, mật ựộ thả 2,5 con/m2.
3.1.1. Số lượng cá thu mẫu ký sinh trùng
Trong suốt quá trình làm ựề tài, tôi ựã tiến hành thu và phân tắch ký sinh trùng trên 480 con cá Hồng ựỏ, trong ựó có 120 con cá giống, 360 con cá thịt ở cả
ao nuôi bằng thức ăn công nghiệp và thức ăn tự chế. Số mẫu thu và phân tắch thể
hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Số lượng mẫu cá thu và phân tắch
Số lượng Quy cỡ
TACN TATC
Giai ựoạn
Ngày
thu TACN TATC
Khối lượng (g) Chiều dài (cm) Khối lượng (g) Chiều dài (cm) 30/7/07 30 30 4,5 6,6 4,5 6,4 Cá giống 23/8/07 30 30 8,4 9,1 8,2 8,7 30/9/07 30 30 44,4 15,1 34,7 14,5 30/10/07 30 30 42,3 14,9 92,1 20 15/11/07 30 30 71,4 17,1 115,8 19,1 Cá thịt 7/4/08 30 30 82,5 17,9 139,3 21,1
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ25
30/6/08 30 30 125,0 22,3 142,0 21,0
24/7/08 30 30 421,4 24,4 438,7 23,9
Tổng 240 240
3.1.2. Thành phần, vị trắ phân loại, cơ quan ký sinh của ký sinh trùng trên Cá Hồng ựỏ thu mẫu tại Quảng Ninh
Qua phân tắch mẫu cá thu ựược, chúng tôi ựã xác ựịnh ựược 8 loại ký sinh trùng thuộc 7 họ, 7 bộ, 5 lớp, 4 ngành ựã nhiễm trên cá Hồng ựỏ nuôi thương phẩm, chủ yếu là ngoại ký sinh trùng. Trong ựó phân loại ựược 6 loài, còn ấu trùng của sán lá song chủ (Trematoda), giun tròn (Larvae Contracaecum sp) chưa xác ựịnh tên loài do số mẫu thu còn ắt. Trùng bánh xe (Trichodina jadranica) và trùng lông (Paranophrys marina) ựược phát hiện nhiễm với mức ựộ cao ở giai ựoạn cá giống và giai ựoạn ựầu của cá thịt. Trong ruột chỉ phát hiện ựược một loài giun tròn ở cá thương phẩm với mức ựộ nhiễm rất thấp. Các loài thuộc nhóm sán (Monogenea, Trematoda), ngoài Megalocotyle lutiani, có nhiễm trên da; các loài còn lại mới chỉ thấy nhiễm trên mang; trên vây chưa phát hiện ký sinh trùng thuộc các lớp này. Kết quả cụ thể ựược trình bầy trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thành phần giống loài ký sinh trùng trên cá Hồng ựỏ thu mẫu tại Quảng Ninh
Cường ựộ nhiễm
STT Tên ký sinh trùng Cơ quan
ký sinh T
ỷ lệ
nhiễm (%) Min. Max. TB
1. Lớp Oligohymenophorea De Puytorac Et Al., 1974
1 Paranophrys marina Thompson et Berger, 1965
Da, mang 11,25 9 87 46,72
2 Trichodina jadranica Raabe, 1958
Mang, da, vây
25,42 1 95 21,59
2. Lớp Monogenea (Van Beneden, 1858) Bychowsky, 1937
3 Euryhaliotrema lutiani
Yamaguti, 1953
Mang 39,79 1 8 2,43
4 Megalocotyle lutiani Lebelev, 1970
Mang, da 0,83 1 2 1,5
3. Lớp Trematoda Carus, 1863
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ26 Manter, 1970
6 Metacercaria Trematoda Mang 3,13 1 3 1,53
4. Lớp Nematoda Ruldophi, 1808
7 Larvae Contracaecum sp Ruột 0,63 1 - 1
5. Lớp Maxillopoda - Dahl, 1956
8 Caligus laticaudus Shiino, 1960 Da 4,58 1 3 1,41
Cường ựộ nhiễm:
- Lớp Oligohymenophorea: trùng/thị trường 4x10
- Lớp Monogenea, Trematoda: trùng/la men; - Lớp Nematoda, Maxillopoda: trùng/cá
3.1.2.1. Loài Paranophrys marina Thompson et Berger, 1965
Ớ Vị trắ phân loại
Ngành: Ciliophora - (Doflein, 1901) Copeland, 1956 - Ciliates Phân ngành: Intramacronucleata - Lynn, 1996
Lớp: Oligohymenophorea - De Puytorac Et Al., 1974 Phân lớp: Scuticociliatia - (Small, 1967)
Bộ: Philasterida - Small, 1967 Họ: Orchitophryidae - Code, 1910
Giống: Paranophrys -
Loài: Paranophrys marina Thompson et Berger, 1965
ỚVật chủ: cá Hồng ựỏ;
ỚNơi ký sinh: mang, da;
ỚNơi tìm thấy: ao nuôi cá Yên Hưng, Quảng Ninh;
ỚHình thái: loài trùng lông chúng tôi phát hiện ựược cơ thể mỏng, có dạng trục quay, lông sắp xếp dầy trên bề mặt. Kắch thước tế bào 35,33-38,00 x 14,67- 15,50ộm (kắch thước này nằm trong phạm vi 30-45 x 10-15ộm mà tác giả Thompson và Berger ựã mô tả năm 1965) (Weibo Song et al, 2002) [32]. Lỗ miệng kắn và bằng khoảng 2/5 chiều dài cơ thể. Một nhân lớn nằm ở giữa với nhiều hạch nhân trên bề mặt, một nhân nhỏ ở phắa trước gắn với nhân lớn. Không bào có thể co rút, lớn, nằm ở cuối phắa sau tế bào.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ27 Loài này ựược mô tả lần ựầu tiên bởi Thompson và Berger năm 1965. Các tác giả này ựã tách ựược chúng từ thủy tức (Plumularia sp.) ở vùng nước gần Friday Harbor (Washington, USA) (Weibo Song et al, 2002) [32].
ỚMức ựộ nhiễm: tỷ lệ nhiễm 11,25%, cường ựộ nhiễm 46,72 trùng/thị trường 4x10.
E F
Hình 3.1: Trùng lông Paranophrys marina(A- mặt bên phải; B- mặt bụng; C- mặt lưng; D- Hệ thống ựường tiêm mao mặt bụng - theo Weibo Song và CTV,
2002); E,F- mẫu tươi
3.2.1.2. Loài Trichodina jadranica Raabe, 1958
Ớ Vị trắ phân loại
Phân lớp: Peritrichia F. Stein, 1859 Bộ: Mobilina Kahl, 1933
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ28 Họ: Trichodinidae Clau, 1874
(Syn.: Urceolariidae F. Stein, 1867; part) Giống: Trichodina Ehrenberg, 1830
Loài Trichodina jadranica Raabe, 1958
(Syn.: Trichodina domerguei f. jadranica Raabe, 1958; Trichodina domerguei f. pleuronectes Raabe, 1958; Trichodina domerguei f. gobii Raabe, 1958;
Trichodina rutili Wu, 1961; Trichodina anguilli Wu, 1961; Trichodina jadranica Lom et Laird, 1969)
Ớ Vật chủ: cá Hồng ựỏ;
Ớ Nơi ký sinh: mang, da, vây;
Ớ Nơi tìm thấy: ao nuôi cá Yên Hưng, Quảng Ninh;
Ớ Hình thái: ựường kắnh cơ thể 37,5-45,8ộ; vòng ựĩa bám 29,2- 33,3; vòng móc