2 Với: n: cỡ mẫu ZP 2
PR(1-α/2)R: hệ số tin cậy. Với α = 5% thì ZR(1-α/2)R= 1,96 p = 0,147
d: sai số mong muốn, được chọn là 0,05 Vậy cỡ mẫu nhỏ nhất là 193 mẫu.
2.1.2.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu
- Các chủng Staphylococci được phân lập tại bệnh viện Nhân dân Gia Định, thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2011. - Chỉ lấy những vi khuẩn phân lập từ những bệnh phẩm lấy đúng vị trí, đúng
cách và đủ tiêu chuẩn.
• Đối với mẫu nước tiểu: chỉ đưa vào nghiên cứu nếu mẫu nước tiểu đạt yêu cầu số lượng vi khuẩn cùng loài ≥ 10P
5 P
• Đối với mẫu đàm: chỉ đưa vào nghiên cứu nếu mẫu đàm đạt yêu cầu về số lượng bạch cầu và tế bào biểu mô sau khi khảo sát vi thể (≥ 25 bạch cầu và ≤ 10 tế bào biểu mô/phết nhuộm Gram ở vật kính 10 theo thang điểm Murry & Washington).
- Lưu ý: loại trừ những mẫu nghi ngờ bị ngoại nhiễm, những mẫu bệnh phẩm có cùng loại vi khuẩn được phân lập trên cùng một bệnh nhân trong các lần phân lập sau.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Vật liệu
− Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, bình cầu, giá ống nghiệm, tăm bông vô trùng, đèn cồn, que cấy, lame, lamel, kẹp, thước đo mm, pipette điện tử, máy đo độ đục McF …
− Thiết bị: cân điện, lò vi sóng, tủ sấy, nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, tủ ủ ấm, tủ lạnh, tủ giữ chủng, kính hiển vi, máy tính, …
− Môi trường:
• Môi trường nuôi cấy Staphylococci:
- Môi trường không ngăn chặn thạch máu BA (Blood Agar), - Môi trường phân biệt có chọn lọc MC (Mac Conkey agar)
• Các loại môi trường định danh: HR2ROR2R, huyết tương, MSA (Mannitol Salt Agar: là môi trường chọn lọc của Staphylococci vì có chứa 7,5% NaCl).
• Các loại thử nghiệm khác dùng định danh: oxidase, polymycin, novobiocin, ure,…
• Môi trường làm kháng sinh đồ là MHA (Mueller Hinton Agar) hoặc môi trường làm kháng sinh đồ máy là ATB medium và ATB medium 2%NaCl.
− Các loại đĩa kháng sinh đại diện cho các nhóm kháng sinh sử dụng cho
Staphylococci của Công Ty Nam Khoa và Bio-Rad. Đĩa kháng sinh là những đĩa giấy có đường kính 6mm được tẩm một dung dịch thuốc kháng sinh với nồng độ tiêu chuẩn, được cất giữ trong các ống có chứa chất chống ẩm, bảo quản trong tủ lạnh.
− Hoặc ATB strip gồm 16 cặp giếng dùng làm kháng sinh đồ cho
Staphylococci.
2.2.2. Phương pháp thực hiện:
Các bệnh phẩm sau khi được lấy bằng các kỹ thuật phù hợp và đạt yêu cầu (Các dụng cụ lấy bệnh phẩm phải tuyệt đối vô khuẩn, dụng cụ chứa đựng bệnh phẩm phải có nắp đậy kín và phải vô khuẩn, lấy bệnh phẩm đúng nơi, đúng thời điểm và lấy đủ số lượng) được dán nhãn ghi rõ họ tên và gửi ngay đến phòng xét nghiệm vi sinh trong vòng 2 đến 4 giờ cùng với phiếu yêu cầu xét nghiệm. Tại đây sẽ thực hiện qui trình cấy phân lập, chọn khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh và làm kháng sinh đồ.
Cấy phân lập và định danh vi khuẩn
− Cấy phân lập các loại bệnh phẩm trên môi trường thích hợp, riêng đối với bệnh phẩm nước tiểu thì cấy định lượng.
− Định danh: chọn các khúm khuẩn nghi ngờ và ghi nhận tính chất nuôi cấy, đặc điểm khúm, nhuộm Gram, thực hiện test Catalase, Oxidase và Coagulase và các thử nghiệm khác để định danh vi khuẩn.
Cầu khuẩn G+ Catalase (+) Oxidase (-) Coagulase (+) (-) Polymycin: S. aureus (R) S. intermdius (S) S. saprophyticus (R) S. epidermidis S. haemolyticus (S) S. lugdunensis Novobiocin:
Bảng 2.1. Quy trình định danh Staphylococci tại bệnh viện Nhân dân Gia Định MSA Ure Orn Pb
S. epidermidis - + V R
S. haemolyticus V - - S
S. lugdunensis - V + V
• Tính chất nuôi cấy: mọc trên BA, không mọc trên MC. Quan sát hiện tượng tiêu huyết, hình dạng và sắc tố khúm: khúm lồi, bờ tròn, có màu trắng đục đến vàng kem, một số có vòng tiêu huyết bêta.
Một số loại Staphylococci như S. aureus có khả năng sinh ra ngoại độc tố hemolysin làm ly giải hồng cầu, làm xung quanh khúm vi khuẩn mọc trên thạch máu xuất hiện vòng sáng tiêu huyết.
• Nhuộm Gram: Staphylococci là cầu khuẩn gram dương, bắt màu xanh tím, sắp xếp dạng chùm nho hoặc rời rạc.
• Thử nghiệm catalase: Men catalase có tác dụng biến hydrogen peroxide (HR2ROR2R) thành nước và khí oxygen. Thử nghiệm này dùng để phân biệt giữa
Staphylococci và Streptococci. 2HR2ROR2R 2HR2RO + OR2R↑
Tiến hành: Nhỏ một giọt hydrogen peroxide 3% lên lame, sau đó đặt lên 1 khúm vi khuẩn, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương, kết luận là
Staphylococci. Nếu không có hiện tượng sủi bọt là phản ứng âm, kết luận là
Streptococci.
Lưu ý: khi lấy vi khuẩn trên môi trường có máu nên lấy ở phần trên của khúm khuẩn để tránh tiếp xúc với môi trường vì hồng cầu có khả năng làm thử nghiệm catalase dương tính giả (do hồng cầu cũng có peroxidase) [2].