pháp điện di SDS - PAGE
Để xác định thành phần protein màng của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành phƣơng pháp điện di SDS - PAGE. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ hình 3.4:
Hình 3.4. Kết quả phân tích protein màng của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm bằng phương pháp SDS-PAGE
Kết quả hình 3.4 cho thấy thành phần protein của 7 chủng phân lập có sự tƣơng đồng rất cao. Tất cả các chủng đều xuất hiện các band protein có khối lƣợng phân tử khoảng 140, 80, 78, 40 kDa. Đa số các chủng xuất hiện các band 160, 150, 62, 52, 38, 35, 31 kDa. Bên cạnh những band tƣơng đồng thì cũng có một số band khác biệt giữa các chủng. Band 58 kDa bắt màu rất đậm chỉ xuất hiện ở chủng NH1 và band 36 kDa chỉ xuất hiện ở chủng NH3. Hai chủng NH2 và VN1 không xuất hiện 2 band protein ở vị trí 160 và 150 kDa.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, các protein có trọng lƣợng phân tử khoảng 52, 48, 43, 38 và 35 kDa là phổ biến ở 5/7 chủng, trong đó có chủng NH3 (nghi ngờ là
V.harveyi). Kết quả này có tính tƣơng đồng cao với nghiên cứu của Yingxue Q. và cs (2007) khi phân tích kháng nguyên của vi khuẩn V.harveyi, chủng TS-628 cho thấy có 5 band protein có trọng lƣợng phân tử khoảng 52, 47, 43, 38, 35 kDa [25]. Một nghiên
175 kDa 80 kDa 58 kDa 46 kDa 30 kDa VN1 NH2 NH1 M M NT1 VN2 NH3 NH4
cứu khác của Wang Q. và cs (2011) khi xác định và đánh giá khả năng sản xuất vaccine của một protein màng OmpU từ V. harveyi cho thấy protein màng OmpU có trọng lƣợng phân tử 35 kDa có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao ở cá bơn [21]. Đây có thể là một ứng cử viên cho việc phát triển vaccine hay kháng thể chống lại nhiều chủng Vibrio.
Kết quả điện di SDS - PAGE chủng NT1 (nghi ngờ là V. alginolyticus) của chúng tôi cho thấy có sự tƣơng đồng với nghiên cứu của Nguyễn Thị Thoa và cs (2011) khi xác định thành phần protein của các chủng vi khuẩn V. alginolyticus phân lập từ cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa ở các band protein khoảng 75, 68, 62, 55, 38, 32 kDa [4]. Chủng NT1 cũng cho kết quả tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của Ding và cs (2011) khi họ kết luận protein có khối lƣợng phân tử 47 và 38 kDa là phổ biển trong thành phần Omp của V.alginolyticus [9].
Một nghiên cứu của Ningqiu Li và cs (2010) đã cho thấy OmpK có trọng lƣợng phân tử trong khoảng 28 - 31 kDa là phổ biến ở các loài Vibrio [15]. Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy sự tƣơng đồng cao với kết quả của nghiên cứu này khi có 6/7 chủng là VN1, NH1, NT1, VN2, NH3, NH4 có band protein ở vị trí khoảng 31 kDa.
Nghiên cứu của chúng tôi còn cho thấy chủng NH3 có xuất hiện 1 band protein ở vị trí khoảng 38 kDa. Kết quả này có sự tƣơng đồng với nghiên cứu của Wang SY và cs (2003) khi phân tích vai trò của protein màng ngoài của V. anguillarum trong kháng mật và hình thành màng sinh học. Họ đã xác định một Omp đƣợc tổng hợp với một lƣợng lớn có trọng lƣợng phân tử 38 kDa [22]. Tuy nhiên, trong kết quả của chúng tôi, band này còn xuất hiện ở NH1, NT1, VN2 và NH4. Protein này có thể là một ứng cử viên cho sản xuất vaccine chống lại V. mimicus, V. alginolyticus, V. diazotrophicus và
V. parahaemolyticus.
Một kết quả khác trong nghiên cứu của chúng tôi là chủng NH1 xuất hiện một band protein khoảng 58 kDa với cƣờng độ màu rất đậm. Band này cũng xuất hiện ở NH3 và VN2 nhƣng bắt màu rất nhạt. Trong phạm vi tìm hiểu của chúng tôi thì chƣa thấy kết quả này tƣơng đồng với các báo cáo về protein màng của V. mimicus đã đƣợc công bố. Do đó, chúng tôi cần có những nghiên cứu sâu hơn trƣớc khi đƣa ra kết luận về protein này.
Khi quan sát kết quả SDS - PAGE của chủng NH3 (nghi ngờ là V. harveyi), chúng tôi nhận thấy có một band protein khoảng 36 kDa bắt màu tƣơng đối đậm và
không xuất hiện ở các chủng còn lại. Kết quả này có sự khác biệt lớn với kết quả nghiên cứu của Tang Xiao-Qian và cs (2009) khi họ kết luận Omp 36 kDa là phổ biến ở 6 loài: V. anguillarum, V. ichthyoenteri, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. harveyi và V. vulnificus [20]. Một nghiên cứu khác của Wei-ni Z và cs (2008) cũng khẳng định Omp 36 kDa đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu nhận dạng cho các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio [23]. Sự khác biệt này có thể do sự phân tách protein chƣa tốt trong thí nghiệm của chúng tôi hoặc do chƣa xác định rõ ràng giữa band 36 và 35 kDa. Chúng tôi cần thực hiện một số nghiên cứu tiếp theo mới có thể đƣa ra kết luận về protein này.
Nhìn chung thành phần protein màng của các chủng phân lập có tính tƣơng đồng rất cao. Có nhiều band xuất hiện ở tất cả hoặc đa số các chủng với sự sai khác cƣờng độ màu không đáng kể nhƣ các band 80, 78, 52, 43, 38, 35 và 31 kDa. Với kết quả này, một phần nào đó có thể cho thấy triển vọng lớn trong việc phát triển một loại vaccine từ protein màng chống lại nhiều chủng Vibrio hay ít nhất là 7 chủng mà chúng tôi đã phân lập đƣợc hoặc cũng có thể tách chiết các protein này để làm kháng nguyên sản xuất kháng thể tăng sức đề kháng với Vibrio cho động vật thủy sản.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Đã phân lập, định danh sinh hóa và lƣu giữ đƣợc 7 chủng vi khuẩn từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa gồm: NH1, NH2, NH3, NH4, VN1, VN2, NT1 có các đặc điểm sinh hóa tƣơng đồng cao với các chủng tƣơng ứng là: V. mimicus, V. anguillarum, V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. anguillarum, V. diazotrophicus và V. alginolyticus.
Thành phần protein màng của 7 chủng có sự tƣơng đồng rất cao ở các band protein có khối lƣợng phân tử khoảng 140, 80, 78, 52, 46, 43, 40, 38, 35 và 31 kDa. Tuy nhiên, vẫn có một số khác biệt ở một vài band có khối lƣợng phân tử khoảng 160, 150, 58, 36 kDa.
2 Kiến nghị
Định danh di truyền các chủng vi khuẩn đã phân lập để xác định chính xác từng chủng vi khuẩn.
Khảo sát các phƣơng pháp tách chiết protein màng để thu đƣợc protein màng tinh khiết với hàm lƣợng cao hơn.
Nghiên cứu so sánh protein màng giữa các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm bệnh với các chủng Vibrio chuẩn để kết quả tin cậy hơn.
Nghiên cứu tách chiết những protein màng có tiềm năng nhƣ protein 78, 43, 38 và 31 kDa để làm vaccine hoặc làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể trong phòng trị bệnh cho thủy sản.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.
2. Đỗ Thị Hòa, Trần Vĩ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ (2008). Các loại bệnh thƣờng gặp trên cá biển nuôi ở Khánh Hòa. Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, số 02, Trƣờng Đại học Nha Trang, trang 16 - 24. 3. Ngô Thị Giang (2013). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng gây
đáp ứng miễn dịch trên gà đẻ trứng của chủng vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập từ cá chẽm. Đồ án Đại học, Trƣờng Đại học Nha Trang.
4. Nguyễn Thị Thoa (2011). Độc lực và thành phần protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa. Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Nha Trang. 5. Nguyễn Thị Thúy An (2013). Phân lập vi khuẩn Vibrio trên cá bớp
(Rachycentron canadum) bị lở loét. Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Cần Thơ. 6. Viên Đại Phúc (2011). Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates
calcarifer) nuôi lồng biển tại Nha Trang Khánh Hòa. Luận văn Thạc sĩ, Viện Nghiên Cứu NTTS III, Khánh Hòa.
Tài liệu tiếng Anh
7. Austin B., Zhang X. H. (2006). Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates. Lett Appl Microbiology, 43(2): 119-124.
8. Bradford M. M. (1976). A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72:248-254.
9. Ding T., Tian-long L., Bin-fu X. (2011). Comparative Characteristics of Outer Membrane Proteins in Bacteria V. vulnificus and V. alginolyticus. Fisheries Science (Biotechnology Institute, the Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China).
10. Holt J. G., N.R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Staley, S. T. Williams (1994).
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition. William & Wilkins. 11. Koqa T., Kawata T. (1983). Isolation and characterization of the outer membrane
12. Laemmli U. K. (1970). Cleavage of structural protein during the assembly of the head of Bacteriophage T4.Nature, 227, 680-685.
13. McCarter L. L., Silverman M. (1987). Phosphate regulation of gene expression in
Vibrio parahaemolyticus. Journal of Bacteriology, 169(8): 3441-3449.
14. Ningqiu L., Junjie B., Shuqin W., Xiaozhe F., Haihua L., Xing Y., Cunbin S. (2008). An outer membrane protein, OmpK, is an effective vaccine candidate for
Vibrio harveyi in Orange-spotted grouper (Epinephelus coioides). Fish Shellfish Immunology, 25(6): 829-833.
15. Ningqiu L., Zhihui Y., Junjie B., Xiaozhe F., Lihui L., Cunbin S., Shuqin W. (2010). A shared antigen among Vibrio species: outer membrane protein-OmpK as a versatile sis vaccine candidate in Orange-spotted grouper (Epinephelus coioides). Fish & Shellfish Immunology, 28(5): 952-956.
16. Poornima M., Vijaya Kumar R., Santiago T. C., Arasu, A. R. T. (2013). Recombinant outer membrane protein, Omp26la of Vibrio anguillarum is an effective vaccine candidate. Journal of Aquatic Biology and Fisheries, 2, pp. 436-440.
17. Sadok Khouadja, Faouzi Lamari, Amina Bakhrouf (2013). Characterization of
Vibrio parahaemolyticus isolated from farmed sea bass (Dicentrarchus labrax ) during disease outbreaks. International Aquatic Research, 5(1): 13.
18. Sobhana, K. S. (2009). Diseases of seabass in cage culture and control measures.
National training on cage culture of seabass, pp. 87-93.
19. Sun K., Zhang W. W., Hou J. H., Sun L. (2009). Immunoprotective analysis of VhhP2, a Vibrio harveyi vaccine candidate. Vaccine, 27(21): 2733-2740.
20. Tang Xiao-Qian, Zhan Wen-Bin, Zhou Li, Sheng Xiu-Zhen (2009). Characterization of 36 kDa Outer Membrane Proteins of Six Pathogenic Species. Periodical of Ocean University of China (The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China).
21. Wang Q., Chen J., Liu R., Jia J. (2011). Identification and evaluation of an outer membrane protein OmpU from a pathogenic Vibrio harveyi isolate as vaccine candidate in turbot (Scophthalmus maximus). Letter Appl Microbiology, 53(1): 22-29.
22. Wang S. Y., Lauritz J., Jass J., Milton D. L. (2003). Role for the major outer- membrane protein from Vibrio anguillarum in bile resistance and biofilm formation. Microbiology, 149(4): 1061-1071.
23. Wei-ni Z., Li Z., Jing X., Wen-bin Z. (2008). Structural comparison of major outer membrane proteins of aquatic animal Vibrio sp. Marine Fisheries Research
(The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China).
24. West P. A., Brayton P. R., Bryant T. N., Colwell R. R. (1986). Numerical Taxonomy of Vibrios Isolated from Aquatic Environments. International Journal Of Systematic Bacteriology, 36: 531-543.
25. Yingxue Q, Jun W, Shifeng W, Qingpi Y (2007). Antigenicity analysis of Vibrio harveyi TS-628 strain. Frontiers of Biology in China, 2(3): 263-267.
26. Yu L. P., Hu Y. H., Sun B. G., Sun L. (2013). Immunological study of the outer membrane proteins of Vibrio harveyi: insights that link immunoprotectivity to interference with bacterial infection. Fish & Shellfish Immunology, 35(4): 1293-1300. 27. Zanal Abiddin, Siti Zubaidah and Mohd Yusoff, Sabri Md, Shamsudin,
Shahirudin (2010). Molecular and antigenicity characterisation of sp. isolates from Asian seabass (Lates Calcarifer), 5th Proceedings of the Seminar on Veterinary Sciences. Serdang, Selangor, 5-8 January 2010. University Putra Malaysia.
Tài liệu internet
28. http://www.assay-protocol.com/molecular-biology/electrophoresis/denaturing-page 29. http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Lates_calcarifer/en
30. http://www.tgw1916.net/bacteria_.html 31. https://www.lifetechnologies.com
PHỤ LỤC A
Dựng đƣờng chuẩn Albumin (BSA) và xác định hàm lƣợng protein trong dịch tách chiết.
1. Bảng kết quả đo OD595 cho BSA chuẩn
Nồng độ BSA (µg/ml) Kết quả OD595 Trung bình OD ΔOD Lần 1 Lần 2 Lần 3 0 1,330 1,328 1,342 1,333 0,000 10 1,361 1,361 1,361 1,361 0,028 20 1,391 1,394 1,405 1,396 0,063 30 1,433 1,420 1,444 1,432 0,099 40 1,467 1,452 1,473 1,464 0,131 50 1,498 1,487 1,487 1,490 0,157 60 1,517 1,528 1,528 1,524 0,191 70 1,538 1,522 1,546 1,535 0,202 80 1,551 1,553 1,551 1,551 0,218 90 1,612 1,601 1,627 1,613 0,280 100 1,660 1,665 1,637 1,654 0,321
2. Đồ thị đƣờng chuẩn BSA với OD595
y = 0,003x + 0,001 R² = 0,987 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 50 100 150 OD Nồng độ protein (µg/ml) Đồ thị đƣờng chuẩn BSA
3.Bảng kết quả đo OD xác định hàm lƣợng protein màng với OD595
Chủng Kết quả OD595 OD Trung bình ΔOD
Lần 1 Lần 2 ĐC 1,171 1,197 1,184 0 NH1 1,872 1,793 1,832 0,648 NT1 1,433 1,526 1,479 0,295 NH2 1,485 1,945 1,715 0,531 VN1 2,033 2,016 2,024 0,840 VN2 1,441 1,561 1,501 0,317 NH3 1,954 1,931 1,942 0,758 NH4 1,642 1,755 1,698 0,514
PHỤ LỤC B
Cách pha các dung dịch hóa chất cho nghiên cứu
1. Monomere solution( 40%)
Acrylamide (FW 71,08) : 10g Bis-acrylamide (FW 154,2) : 0,2g Nƣớc cất cho đến 25ml
Giữ đƣợc 3 tháng trong tối ở 4oC
(Acrylamide là chất độc thần kinh, khi thao tác phải cẩn thận)
2. 4X Resolving gel buffer (0,5M Tris HCl, pH 8,8)
Tris base (FW 121,1) : 1,815g Nƣớc cất thêm 7,5ml
Chỉnh pH 8,8 với HCl đậm đặc Thêm nƣớc cất đến 10ml Giữ đƣợc 3 tháng trong tối ở 4o
C
3. 4X Stacking gel buffer (0,5 Tris HCl, pH 6,8)
Tris base (FW 121,1) : 1,5g Nƣớc cất thêm 20 ml
Chỉnh pH 6,8 với HCl đậm đặc Thêm nƣớc cất đến 25ml
Giữ đƣợc 3 tháng trong tối ở 4oC
4. SDS 10% SDS 2,5g Nƣớc cất cho đến 25ml Giữ đƣợc 6 tháng ở nhiệt độ phòng 5. Ammonium persulfate Ammonium persulfate 0,2g Nƣớc cất cho đến 2ml
Pha để dùng ngay không để lại
6. 2X Treatment buffer
4X Stacking gel buffer 2,5ml SDS 10% 4ml
Dithiothreitol (DTT) ( FW 154,2) 0,31g Bromophenol Blue 0,002g
Thêm nƣớc cất cho đến 10ml
Chia nhỏ thành các thể tích 0,5 ml giữ đƣợc trong 6 tháng ở -20oC
7. Tank buffer (0,025M Tris HCl; 0,192M Glycine; 0,1% SDS; pH 8,3)
Tris (FW 121,1) 3,028g Glycine 14,413g SDS 1g Nƣớc cất cho đến 1 lít Giữ đƣợc 1 tháng ở nhiệt độ phòng 8. Resolving gel 15% Monomere 40% 3,8 ml 4X Resolving gel 2,5 ml SDS 10% 0,1 ml Nƣớc cất 3,6 ml APS 10% 100 µl TEMED 10 µl 9. Stacking gel 5% Monomere 40% 1,3 ml 4X Stacking gel 2,5 ml SDS 10% 0,1 ml Nƣớc cất 6,2 ml APS 10% 50 µl TEMED 10 µl
10. Dung dịch nhuộm gel (Staining solution)
Coomassie Brilliant Blue G- 250: 0,025g Methanol: 40 ml
Acid acetic : 10 ml
Bổ sung nƣớc cất vừa đủ 100 ml
11. Dung dịch rửa màu
Methanol : 40 ml Acid acetic : 10 ml
Nƣớc cất vừa đủ 100 ml
12.Thuốc thử Bradford
Hòa tan 0,01g Coomassive Brilliant Blue G-250 vào 5 ml ethanol 96%, sau đó thêm 10 ml H3PO4 85% rồi định mức lên đến 100 ml bằng nƣớc cất.