Nội dung nghiên cứu

2.2.1.Phương pháp bào chế viên nang amlodipin 5mg

2.2.1.1.Phương pháp tạo hạt khô:

Bào chế viên nang amlodipin 5 mg theo phương pháp tạo hạt khô với các tá dược: comprecel M102, tá dược siêu rã, era-gel. Mỗi mẻ 500 viên.

27

Sơ đồ 1: Sơ đồ bào chế viên nang amlodipin 5 mg theo phương pháp tạo hạt bằng dập viên

Các bước bào chế như sau:

- Amlodipin besilat, Comprecel M102, Era-gel, tá dược trơn và các tá dược siêu rã rây qua cỡ rây 180

Cân Nghiền, rây Trộn bột kép Trộn Dập viên Xát hạt Sửa hạt Bao trơn Đóng nang Amlodipin, Sodium Starch

Glycolate, Comprecel M102

Era-gel Magnesi stearat

28

- Trộn đồng lượng amlodipin besilat với Comprecel M102, sau đó trộn với tá dược siêu rã và các tá dược dính khô, tá dược trơn cho đồng nhất

- Dập viên trên máy dập ZP7, chày cối đường kính 13mm, dập viên để đạt lực gây vỡ viên khoảng 4 – 5KN.

- Xát viên thành hạt qua rây 1000 (Cỡ mắt rây 1mm) - Tá dược trơn rây qua cỡ rây 125, trộn với hạt.

- Đóng nang bằng tay/ máy đóng nang tự động KDF-2 với khối lượng viên dự kiến Mdk = 150mg/viên. Hạt được bào chế đem đóng nang trên máy đóng nang tự động: máy có 05 chặng tiếp liệu, mỗi chặng có 09 piston. Hạt được đóng thành thỏi đường kính 5,5 mm, chiều cao 10,5 mm và nhả vào nang số 2.

- Viên sau khi bào chế được để ổn định 24h trong túi polyethylen, tránh ánh sáng để sử dụng cho các thực nghiệm đánh giá.

2.2.1.2.Phương pháp tạo hạt ướt:

Bào chế viên nang amlodipin 5 mg theo phương pháp xát hạt ướt với các tá dược: Comprecel M101, tá dược siêu rã. Tá dược dính là era-gel, tinh bột, PVP/ nước cất. Mỗi mẻ 500 viên.

29

Viên nang amlodipin 5 mg được bào chế theo sơ đồ 2

Sơ đồ 2: Sơ đồ bào chế viên nang amlodipin 5 mg theo phương pháp tạo hạt ướt

Các bước bào chế như sau:

- Amlodipin besilat, comprecel M101, các tá dược siêu rã rây qua cỡ rây 180 - Trộn đồng lượng amlodipin besilat với comprecel M101, sau đó trộn với tá dược siêu rã cho đồng nhất

- Phân tán era-gel trong nước cất thu được tá dược dính có nồng độ 5% Cân Nghiền, rây Trộn bột kép Nhào ẩm Xát hạt Sấy cốm Sửa hạt Trộn cốm khô Đóng nang Amlodipin, Sodium Starch

Glycolate, Microcrystalline cellulose

Pregelatinized starch /Nước cất

30

- Phối hợp tá dược dính với hỗn hợp bột để tạo khối ẩm - Xát hạt qua kích thước mắt rây 1mm

- Sấy hạt ở nhiệt độ 55°C đến khi hạt có độ ẩm < 3% - Tá dược trơn rây qua cỡ rây 125, trộn với hạt khô.

- Đóng nang bằng tay/ máy đóng nang tự động KDF-2 với khối lượng viên dự kiến Mdk = 150mg/viên. Hạt được bào chế đem đóng nang trên máy đóng nang tự động: máy có 05 chặng tiếp liệu, mỗi chặng có 09 piston, tốc độ đóng của mâm quay khoảng 1500 – 1800 Hz.

- Viên sau khi bào chế được để ổn định 24h trong túi polyethylen, tránh ánh sáng để sử dụng cho các thực nghiệm đánh giá.

2.2.2.Phương pháp đánh giá

2.2.2.1. Phương pháp xác định kích thước tiểu phân của nguyên liệu amlodipin besilat

Cân chính xác khoảng 25,0 g amlodipin besilat, cho vào các cỡ rây thích hợp, lắc theo chiều ngang quay tròn trong 25 phút. Cân đúng số lượng còn lại trên rây và số lượng thu được trên hộp hứng. Mỗi lô làm 03 lần, lấy kết quả trung bình.

2.2.2.2.Phương pháp đánh giá độ rã của viên:

Thử theo phụ lục 11.6 Dược điển Việt Nam IV

2.2.2.3.Phương pháp đánh giá độ đồng đều khối lượng:

Thử theo phụ lục 11.3. Phép thử đồng đều khối lượng - Dược điển Việt Nam IV

2.2.2.4.Phương pháp xác định tỷ trọng biểu kiến

Tỷ trọng biểu kiến của khối bột, hạt được đo trên máy đo Pharma test. Mỗi mẫu làm 03 lần, tần số rung 50Hz, thời gian rung 5 phút.

Tỷ trọng riêng biểu kiến được tính theo công thức:

D

= ^M

V

- DBK: tỷ trọng biểu kiến của khối bột (g/ml) - M: khối lượng của khối bột (g)

31

Trọng lượng bột chứa trong vỏ nang số 2 theo thiết kế công thức là 150mg/viên, vì dung tích vỏ nang số 2 là 0,37 ml do đó yêu cầu tỷ trọng biểu kiến > 0,40 (g/ml)

2.2.2.5.Xác định độ trơn chảy và tốc độ trơn chảy:

a. Xác định tốc độ trơn chảy của hạt:

Nguyên tắc xác định: một khối lượng xác định bột thích hợp (70 - 100g) được đổ vào một phễu đặt trên máy xác định tốc độ trơn chảy BEP - 2 có độ rung với tần số thích hợp, thời gian chảy hết khối bột qua phễu được máy tự động ghi báo tính ra độ trơn chảy hiển thị bằng gam/giây.

b. Xác định độ trơn chảy của hạt được đánh giá thông qua chỉ số nén (Carr):

Chỉ số carr = ^{(V0− Vt)} V_t ^{x 100} Tỉ số Hausner = ^V0 V_t V0: thể tích ban đầu (ml) Vt: thể tích biểu kiến (ml)

Chỉ số nén thấp tương đương với độ trơn chảy tốt

Bảng 4: Tương quan giữa chỉ số nén và khả năng trơn chảy theo USP 37

Chỉ số nén (%) Độ trơn chảy < 10 Rất tốt 11-15 Tốt 16-20 Khá tốt 21-25 Tạm được 26-31 Kém 32-37 Rất kém >38 Rất rất kém

Bảng 5: Tương quan giữa tỷ số Hausner và khả năng trơn chảy

32

Rất tốt ≤ 1,18

Tốt 1,18 – 1,34

Kém ≥ 1,35

2.2.2.6. Xác định độ tan bão hòa nguyên liệu amlodipin besilat:

- Cân 1 lượng amlodipin besilat nguyên chất, cho vào cốc có mỏ gồm khoảng 10ml môi trường cần khảo sát.

- Tiến hành lắc siêu âm trên máy ở nhiệt độ 30°C ± 10C trong 2 tiếng.

- Sau đó mang ly tâm/5phút. Dung dịch được lọc qua màng 0.45µm và pha loãng thích hợp rồi mang đo quang ở 360nm.

2.2.2.7. Phương pháp đo độ ẩm của hạt:

Sử dụng cân xác định độ ẩm nhanh AMB 50. Mỗi lần thử 2g hạt cốm. Nhiệt độ sấy 50°C, sấy đến độ ẩm không đổi.

2.2.2.8. Phương pháp định lượng amlodipin trong viên nang:

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Thuốc thử: Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.

- Acetonitril (TT). - Triethylamin (TT).

- Acid phosphoric đặc (TT). - Methanol (TT).

- Dung dịch đệm phosphat pH = 3,0.

Cách pha: Thêm 7ml triethylamin vào 1.000 ml nước và chỉnh về pH = 3,0 bằng acid phosphoric đặc, trộn đều rồi lọc qua màng lọc có kích thước 0,45m.

Điều kiện sắc ký:

- Cột Lichrosorb Rp 18 (250 x 4mm ; 10m).

- Pha động: Acetonitril : Methanol : Dung dịch đệm phosphat pH = 3,0 (60 : 30 : 10) (Thay đổi tỷ lệ nếu cần)

- Detector UV 237 nm. - Tốc độ dòng 2ml/ phút.

33 - Thể tích tiêm: 20l.

Tiến hành:

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 35mg Amlodipin besilat chuẩn (tương đương khoảng 25mg Amlodipin base) hoà tan trong 100ml pha động. Hút chính xác 5ml dung dịch này pha loãng với pha động thành 25ml. Lọc qua màng lọc có kích thước 0,45m thu được dung dịch chuẩn.

- Dung dịch thử: Cân 20 nang, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, trộn đều và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc có chứa khoảng 5mg amlodipin base, hoà tan trong 100ml pha động. Lọc qua giấy lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, rồi lọc tiếp qua màng lọc có kích thước 0,45m thu được dung dịch thử.

- Tiến hành tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký.

- Tính hàm lượng amlodipin base có trong viên dựa vào diện tích peak thu được của dung dịch chuẩn và dung dịch thử và hàm lượng của amlodipin besilat chuẩn. Hệ số chuyển đổi từ amlodipin besilat sang amlodipin base là 0,724638.

2.2.2.9. Phương pháp định lượng tạp chất liên quan:

- Tiến hành bằng phương pháp sắc lý lỏng (Phụ lục 5.3 – DĐVN IV). - Điều kiện sắc ký:

+ Cột thép không gỉ (15 cm × 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 m). + Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 237 nm.

+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/min + Thể tích tiêm: 10 μl

Dung dịch thử: Cân 20 viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 50 mg amlodipin, hòa tan trong pha động và pha loãng thành 50 ml với pha động.

Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 5,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml với pha động và pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 50,0 ml với pha động.

34

Dung dịch phân giải: Hòa tan 5 mg amlodipin besilat chuẩn trong 5 ml dung dịch hydrogen peroxyd đậm đặc (TT). Đun nóng ở 70 °C trong 45 phút.

Cách tiến hành:

Thời gian lưu tương đối giữa amlodipin và 3-ethyl 5-methyl(4RS)-4-(2- clorophenyl)-6-methyl-2-[[2-[[2-(methylcarbamoyl)benzoyl]amino]ethoxy]me- thyl]-1,4-dihydropyridin-3,5dicarboxylat (tạp A) là khoảng 0,5.

Tiêm dung dịch phân giải, phép thử chỉ có giá trị khi độ phân giải giữa pic tương ứng với amlodipin và tạp A ít nhất là 4,5.

Tiêm dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Tiến hành sắc ký đối với dung dịch thử trong khoảng thời gian gấp 3 lần thời gian lưu của amlodipin. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, hai lần diện tích của pic tương ứng với tạp A không được lớn hơn diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,5 %). Tổng diện tích của tất cả các pic tạp khác không được lớn hơn diện tích của pic chính trên trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,5 %). Bỏ qua pic tương ứng với benzen sulfonat (thời gian lưu tương đối khoảng 0,2) và bất kỳ pic nào có diện tích nhỏ hơn 0,1 lần diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,05 %).

2.2.2.10. Phương pháp đánh giá mức độ và tốc độ hòa tan amlodipin:

a. Xác định mức độ và tốc độ hoà tan của nguyên liệu, hạt, nang amlodipin bằng phép thử nghiệm hoà tan với các điều kiện như sau:

- Sử dụng máy thử độ hoà tan thiết bị kiểu giỏ quay - Tốc độ: 75 vòng/ phút

- Nhiệt độ môi trường hoà tan: 37°C ± 0,5°C

- Môi trường hoà tan: 500 ml dung dịch acid hydrocloric 0,05M

- Khối lượng mẫu thử: amlodipin nguyên liệu và viên nang tương ứng với 5mg amlodipin base

* Tiến hành:

- Cho mẫu thử vào cốc chứa môi trường hoà tan, cho máy hoạt động. Sau từng khoảng thời gian 5, 15, 30 phút lấy mẫu một lần. Mỗi lần hút chính xác 15ml dung dịch thử, lọc, bổ sung 15 ml HCl 0,05M vào cốc hoà tan.

35

- Mẫu vỏ nang rỗng: Lấy một vỏ nang rỗng, lau sạch bột thuốc trong nang, tiến hành thử trong cùng điều kiện với mẫu thử.

- Mẫu chuẩn: Cân chính xác một lượng amlodipin besilat chuẩn tương ứng với khoảng 50mg amlodipin base vào bình định mức dung tích 100ml, thêm 50ml dung dịch acid hydrocloric 0,05M, lắc kỹ cho tan sau đó thêm vừa đủ bằng dung dịch acid hydrocloric 0,05M (TT). Hút chính xác 1ml dung dịch này pha loãng thành 50ml bằng dung dịch acid hydrocloric 0,05M.

- Đo mật độ quang của dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu vỏ nang rỗng và dung dịch mẫu chuẩn ở bước sóng cực đại 360 nm, cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là dung dịch acid hydrocloric 0,05M. Mỗi mẫu thử 3 lần, lấy kết quả trung bình.

- Dựa vào hiệu số giữa mật độ quang của mẫu thử và mẫu vỏ nang rỗng; mật độ quang của dung dịch chuẩn, hàm lượng của chuẩn để tính lượng amlodipin base hòa tan so với lượng ghi trên nhãn. Hệ số chuyển đổi từ amlodipin besilat sang amlodipin base là 0,724638.

* Cách tính kết quả:

- Nồng độ amlodipin chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ n: C_n = ^{Dn0 x C0}

D₀ ^{x ∝}

+ D0: Độ hấp thụ của dung dịch thử. + C0: Nồng độ dung dịch chuẩn (μg/ml). + D0: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn + α: Độ pha loãng (α = 1).

+ Nồng độ amlodipin sau khi hiệu chỉnh trong mẫu ở lần hút thứ n được tính theo công thức Nelson: C_{n =} C_n0+ ^V0 V ^{x ∑ Ci} n−1 i=1 Cn: Nồng độ hiệu chỉnh ở lần hút thứ n (μg/ml). Cn0: Nồng độ chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ n (μg/ml). V0: Thể tích dịch hoà tan đã hút (V0 = 15ml).

36

Ci (i = n - 1): Nồng độ chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ i (μg/ml).

- Phần trăm amlodipin hoà tan tại thời điểm t được tính theo công thức: C% = ^{Cn x 500}

1000 x m ^{x 100}

- Cn: Nồng độ hiệu chỉnh ở lần hút thứ n - m: Hàm lượng amlodipin trong mẫu

b. Xác định mức độ và tốc độ hoà tan của viên nang amlodipin trên In vitro theo hướng dẫn của FDA:

- Thử độ hòa tan: theo hướng dẫn chung qui định trong Dược điển Mỹ 37 (Dissolution <711>) với một số điều kiện cụ thể như sau:

- Thiết bị: giỏ quay - Tốc độ: 75 vòng/phút

- Môi trường: 500 mL, 3 môi trường có pH 1,2; 4,5 và 6,8 - Nhiệt độ môi trường hoà tan: 370C  0,50C

- Phương pháp định lượng:

Thực hiện theo mục 2.2.2.9.Phương pháp đánh giá mức độ và tốc độ hòa tan amlodipin

- Tiến hành:

Thử trên 3 môi trường pH khác nhau. (pH1,2 ; pH4,5 ; pH6,8), ít nhất 12 viên trong một môi trường.

Thời điểm lấy mẫu: 5 phút, 15 phút, 30 phút - Môi trường pH 1,2: 15 phút

- Môi trường pH 4,5: 5, 15, 30 phút. - Môi trường pH 6,8: 5, 15, 30 phút.

Đánh giá kết quả:

- Trường hợp cả hai chế phẩm thuốc thử và thuốc đối chứng hòa tan rất nhanh trong môi trường nào đó (≥ 85% hàm lượng ghi nhãn hòa tan trong 15 phút) thì hai chế phẩm có độ hoà tan tương đương nhau, không cần phải so sánh biểu đồ hòa tan và hệ số f2.

37

f2 = 50 x log 100 x [ 1 + (1/n) t=1ⁿ (Rt – Tt)²]^-0,5

trong đó: Rt và Tt lần lượt là phần trăm hòa tan tích lũy tại mỗi trong n điểm đã chọn của thuốc đối chứng và thuốc thử.

Nếu hệ số f2 bằng 50 - 100, chế phẩm thử có độ hòa tan tương đương in vitro với chế phẩm đối chứng.

2.2.2.11. Đánh giá sơ bộ độ ổn định của viên nang amlodipin 5mg đã lựa chọn

Tiến hành đánh giá độ ổn định của viên nang cần nghiên cứu trong các điều kiện sau:

Mẫu 1: đóng trong vỉ nhôm - PVC; bảo quản tại phòng theo dõi độ ổn định có kiểm soát nhiệt độ và độ ẩm ở điều kiện: nhiệt độ 30°C ± 2°C; độ ẩm tương đối: 75% ± 5%.

Mẫu 2: đóng trong vỉ nhôm - PVC, bảo quản ở điều kiện lão hoá cấp tốc: - Thiết bị bảo quản: tủ vi khí hậu.

- Nhiệt độ: 40°C ± 2°C.

- Độ ẩm tương đối: 75% ± 5%.

Sau các khoảng thời gian bảo quản nhất định, tiến hành đánh giá các mẫu nghiên cứu dựa trên các chỉ tiêu:

+ Hình thức.

+ Hàm lượng dược chất. + Độ hoà tan dược chất.

2.2.2.12.Phương pháp xử lý số liệu

Dữ liệu được tính toán nhờ phần mềm Excel 2013 (Microsoft., USA). Các thí nghiệm được tiến hành ba lần và biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.

38

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1.Khảo sát sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang với nồng độ dược chất

- Đường chuẩn amlodipin được xây dựng trong môi trường pH khác nhau. (pH1,2 ; pH4,5 ; pH6,8) dùng để xác định độ hòa tan amlodipin trong viên

- Cách tiến hành:

Cân chính xác khoảng 50mg amlodipin chuẩn cho vào bình định mức 200ml, cho thêm khoảng 150ml HCl 0,05M, lắc siêu âm 15 phút. Bổ sung HCl 0,05M vừa đủ đến vạch được dung dịch gốc có nồng độ 25mg/ml.

Từ dung dịch gốc tiến hành pha các dung dịch có dãy nồng độ 2,5; 5; 10; 15; 20; 25 µg/ml trong HCl 0,05M như sau:

Dung dịch gốc Bình định mức Nồng độ (µg/ml) 1 ml  100 ml 2,5 2 ml  100 ml 5 4 ml  100 ml 10