- Vi krìằn Gram (+):
Các vi khuẩn trước khi thử được nuôi cấy, nhân giống vào các ống thạch nghiêng (MT2) ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ Sau đó, dùng que cấy lấy một
lượng nhỏ hoà vào ống nghiệm có chứa 1,5ml MT1 đã tiệt khuẩn, để ở nhiệt độ thích hợp (37°C) trong 18- 24 giờ. Các vi khuẩn đem thử có dạng nhũ dịch vi khuẩn với nồng độ 106-107 tế bào/ml MT1.
• Chuẩn bị chất thử:
Các mẫu thử được pha thành các dung dịch có nồng độ 5mg/ml trong dung môi N,N - dimethyl formamid (DMF). Thấm dịch thử vào khoanh giấy sắc ký đường kính 6,6mm (đã tiệt trùng) với một lượng như nhau sao cho mỗi khoanh giấy có khoảng 0,3 - 0,4mg hoạt chất, để bay hơi hết dung môi.
• Chuẩn bị môi trường:
Sau khi pha chế, MT2 được đóng vào các bình nón dung tích 100ml với 65mlMT/bình, nút bông, rồi đem hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°c trong 20 phút. Để nguội đến 45 - 50°c rồi trộn nhũ dịch vi khuẩn vào.
• Tiến hành:
Trên các hộp petri có đường kính bằng nhau đổ 21 ml môi trường. Khi thạch nguội đặt các khoanh giấy tẩm chất thử lên bề mặt thạch, phân bố cân đối theo một sơ đồ nhất định.
Để các đĩa petri ở nhiệt độ phòng trong khoảng 2h cho hoạt chất khuếch tán vào môi trường. Đọc kết quả sau 18 - 20h nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp 36 - 37°c. Đo đường kính vòng ức chế bằng thước kẹp có độ chính xác đến 0,0lmm.
2.2.3.5. Kết quả:
- Chúng tôi tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của 6 hợp chất azomethin tổng hợp được (I, II, III, IV, V, VI) ở nồng độ 5mg/ml song song với chất chuẩn so sánh là sulfamethoxazole ở cùng nồng độ.
- Kết quả thu được là đọc đường kính vòng ức chế sự phát triển của vi khuẩn của các hợp chất azomethin và sulfamethoxazole. Kết quả được ghi chi tiết ở bảng 8 là kết quả trung bình của 3 lần làm ở cùng điều kiện.
- Kết luận: Trong số các azomethin tổng hợp được đem đi thử khả năng kháng khuẩn (I, II, III, IV, V, VI) thì trừ hợp chất VI, các hợp chất còn lại đều có khả năng khuẩn (I, II, III, IV, V, VI) thì trừ hợp chất VI, các hợp chất còn lại đều có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn kiểm định gần như tương đương với sulfamethoxazole.
Bảng 8: Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của các hợp chất azomethin tổng hợp được S T T V I S I N H V Ậ T K I Ể M Đ Ị N H ( 1 0 6 - 1 0 7 v i k h u ẩ n / m l ) E C P r o S h i S a l P s e u S t a B C B P B S S L Đường kính vòng ức chế (mm) 1 I 2 4 , 5 5 2 5 , 3 0 2 5 , 3 0 2 5 , 6 0 2 2 , 9 3 2 5 , 7 7 2 4 ,1 1 2 4 , 8 0 2 3 , 8 3 2 3 , 1 0 2 I I 2 3 , 8 0 2 4 ,1 1 2 5 , 3 0 2 3 , 6 9 2 2 , 8 3 2 6 , 1 0 2 4 ,0 3 2 3 , 5 0 2 2 , 1 4 2 3 , 6 0 3 I I I 2 3 , 0 2 2 2 , 9 3 2 5 , 0 9 2 4 ,2 3 2 4 , 2 2 2 3 ,6 3 2 4 , 9 0 2 6 , 4 9 2 4 , 2 2 2 4 ,1 1 4 I V 2 5 , 3 3 2 5 , 0 4 2 4 ,1 7 2 4 ,7 1 2 2 ,9 1 2 5 , 3 0 2 3 , 9 2 2 4 , 1 2 2 4 ,6 1 2 4 , 7 7 5 V 2 3 , 2 7 2 4 , 4 5 2 4 , 9 0 2 3 , 4 0 2 2 ,5 1 2 2 , 3 7 2 4 ,0 3 2 2 , 0 7 2 2 , 6 7 2 2 , 6 9 6 V I - + / - + / - - + / - 8 ,8 5 - + / - - - 7 S M Z 2 4 ,9 1 2 4 , 6 0 2 5 ,0 8 2 4 ,9 3 2 4 , 6 5 2 5 , 4 0 2 2 , 1 0 2 3 , 7 0 2 5 , 1 4 2 4 , 7 3 Ghi chú: (-) : không có tác dụng (+/-): tác dụng không rõ SMZ: Sulfamethoxazole 2.3. BÀN LUẬN: 2.3.1. Về tổng hợp hoá học:
- Từ sulfamethoxazole tiến hành phản ứng ngưng tụ loại nước với các aldehyd thơm, chúng tôi đã tổng hợp được 6 base azomethin trong đó có 5 chất chưa tìm thấy trong các tài liệu tham khảo được (trừ chất VI).
- Phản ứng tổng hợp azomethin được tiến hành trong dung môi ethanol tuyệt đối, là dung môi khan nước, phân cực, hoà tan tốt sulfamethoxazole và các aldehyd thơm đồng thời làm thuận lợi cho phản ứng vì làm tăng độ phân cực của nhóm carbonyl. Ethanol tuyệt đối có nhiệt độ sôi thấp (78,5°C) nên hạn chế được sự phân huỷ các azomethin, góp phần làm tăng hiệu suất phản ứng. Hon nữa, trong dung môi ethanol tuyệt đối nóng các azomethin dễ tan, và trong ethanol lạnh thì ít tan, vì vậy dễ kết tinh thu được sản phẩm.
- Phản ứng được tiến hành ở pH 6, ở pH này các aldehyd được hoạt hoá mạnh, và sulfamethoxazole ở dạng tự do có khả năng phản ứng cao.
- Hiệu suất của phản ứng không chỉ phụ thuộc vào cấu trúc hoá học mà còn phụ thuộc vào các điều kiện tiến hành phản ứng (pH, nhiệt độ, thời gian). Phương pháp tinh chế và hệ dung môi kết tinh lại cũng là một yếu tố ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất. - Các azomethin tổng hợp được đều là những chất rắn kết tinh có màu từ trắng,
trắng ngà đến vàng cam, và nâu, tan tốt trong DMF, aceton, ethyl acetat; không tan trong ether dầu hoả, n- hexan và nước; ít tan trong alcol lạnh, tan nhiều hơn trong alcol nóng...
- Dựa vào độ tan của sulfamethoxazole, các aldehyd thơm và các azomethin trong các dung môi, chúng tôi đã tiến hành tinh chế các azomethin bằng phương pháp kết tinh lại các azomethin trong ethanol tuyệt đối.
- Tiến hành kiểm tra cấu trúc của các chất tổng hợp được bằng phổ ƯV, IR, cho thấy các chất azomethin có cấu trúc phù hợp với dự kiến. Vì điều kiện không cho phép nên chúng tôi chỉ có thể đo phổ MS của hai đại diện (chất I và II) trong số sáu chất tổng hợp được. Kết quả cho thấy cả hai chất (I, II) đều có pic phân tử và các mảnh phù hợp với cấu trúc dự kiến tổng hợp.
2.3.2. Về thăm dò tác dụng sinh học:
- Các azomethin tổng hợp được thử tác dụng trên 10 chủng vi khuẩn với chất chuẩn là sulfamethoxazole thì các azomethin I, II, III, IV, V có tác dụng ức chế tốt sự phát triển của tất cả các chủng vi khuẩn đem thử ở nồng độ 5mg/ml, có chất có tác dụng mạnh hơn chất chuẩn ở một số chủng như chất III, IV, có chất có tác dụng yếu hơn không đáng kể so với chất chuẩn như chất I, II, V. Trái lại, azomethin VI chỉ có tác dụng trên vi khuẩn Staphylococcus aureus nhưng rất yếu.
- Vì điều kiện không cho phép nên chúng tôi chỉ có thể thực hiện thử tác dụng kháng khuẩn của các chất tổng hợp được. Tuy nhiên, các kết quả thu được chỉ ở mức độ thăm dò, vì vậy muốn có kết luận chính xác thì phải thử tác dụng kháng khuẩn của các chất tổng hợp được ở nhiều nồng độ và trên nhiều chủng vi khuẩn hơn.
Để đưa ra kết luận chính xác và đầy đủ hơn về sự hiệp đổng tác dụng giữa cấu trúc sulfamethoxazole và cấu trúc azomethin cần phải có thêm nhiều thời gian, chúng tôi rất mong sẽ có điều kiện được tiếp tục nghiên cứu tổng hợp và tác dụng sinh học của các azomethin - dẫn chất sulfamethoxazole ở mức độ nghiên cứu sâu hơn.