Hình 3.8. Phổ hấp thụ của dung dịch AMO 100 mg/L, CLO 100 mg/L và hỗn hợp AMO 100 mg/L + CLO 100 mg/L
Đƣờng 1: dung dịch CLO 100mg/L + AMO 100mg /L Đƣờng 2: dung dịch CLO 100mg/L
Đƣờng 3: dung dịch AMO 100mg /L
Về nguyên tắc không thể tiến hành định lƣợng đồng thời AMO và CLO trong hỗn hợp hai thành phần bằng quang phổ tử ngoại do sự đan xen phổ (Hình 3.8). Để định lƣợng AMO và CLO trong chế phẩm bằng phƣơng pháp quang phổ
27
truyền thống phải tiến hành tách chiết riêng từng hoạt chất rồi đo quang ở bƣớc sóng thích hợp. Tuy nhiên, phƣơng pháp này thƣờng đòi hỏi kỹ thuật xử lý mẫu phức tạp và/hoặc tiêu tốn thời gian. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật phổ đạo hàm (PĐH, PĐHTĐ) đƣợc khảo sát cho phép định lƣợng đồng thời và trực tiếp AMO và CLO không qua giai đoạn chiết tách.
Theo Hình 3.8 khảo sát tính chất cộng tính của mật đô quang đối với dung dịch AMO, CLO có cùng nồng độ 100mg/L và hỗn hợp AMO- CLO cũng có nồng độ 100mg/L đƣợc thể hiện tại Phụ lục 01. Từ đó nhận thấy từ bƣớc sóng 200 nm đến 245 nm không thể hiện tính cộng tính của độ hấp thụ quang, tuy nhiên từ bƣớc sóng 245 nm đến bƣớc sóng 275 nm thể hiện đúng tính cộng tính khi mật độ quang của hỗn hợp AMO và CLO bằng tổng mật độ quang của dung dịch AMO với dung dịch CLO có cùng nồng độ.
3.1.2.1. Chọn bước sóng định lượng đồng thời Amoxicillin và Cloxacillin.
Theo lý thuyết, đối với phƣơng pháp PĐH và PĐHTĐ 2 yếu tố chính ảnh hƣởng đến kết quả là bƣớc sóng định lƣợng và các thông số của phép lấy đạo hàm, phép làm trơn phổ đồ.
Phƣơng pháp phổ đạo hàm
- Lấy đạo hàm bậc nhất của phổ hấp thụ của đơn chất CLO và AMO (60 - 140mg/L) từ bƣớc sóng 210nm đến 280nm và xử lí PĐH bằng chức năng smooth. Nhận thấy tại 2 bƣớc sóng 258,7nm và 271,6nm giá trị PĐH bậc nhất của AMO bằng 0, vì thế giá trị PĐH bậc nhất của hỗn hợp chỉ phụ thuộc vào giá trị PĐH bậc nhất của CLO (tức là chỉ phụ thuộc vào nồng độ CLO). Tuy nhiên tại bƣớc sóng 271,6nm giá trị PĐH của CLO nhỏ nên sai số định lƣợng lớn. Bƣớc sóng 258,7nm đƣợc chọn làm bƣớc sóng định lƣợng CLO. Trên PĐH bậc nhất chúng tôi không chọn đƣợc bƣớc sóng định lƣợng AMO.
28
Hình 3.9. PĐH bậc nhất của dung dịch AMO nồng độ (60 – 140 mg/L) Đƣờng 1 : Nồng độ Amoxicillin 60mg/L
Đƣờng 2 : Nồng độ Amoxicillin 80mg/L Đƣờng 3 : Nồng độ Amoxicillin 100mg/L Đƣờng 4 : Nồng độ Amoxicillin 120mg/L Đƣờng 5 : Nồng độ Amoxicillin 140mg/L
- Lấy đạo hàm bậc hai của phổ hấp thụ của 2 đơn chất AMO và CLO từ bƣớc sóng 210nm đến 280nm và xử lí PĐH bằng chức năng smooth. Nhận thấy tại 2 bƣớc sóng 264,3 nm và 268,9 nm giá trị PĐH bậc 2 của AMO và CLO bằng 0, vì thế giá trị PĐH bậc hai của hỗn hợp lần lƣợt tại hai bƣớc sóng này chỉ phụ thuộc vào giá trị PĐH bậc 2 của CLO và AMO. Tuy nhiên tại 2 bƣớc sóng này sai số định lƣợng là khá lớn do cƣờng độ tín hiệu nhỏ, nên chúng tôi không lựa chọn để định lƣợng AMO và CLO.
29
Hình 3.10. PĐH bậc 2 của dung dịch CLO nồng độ (60 – 140 mg/L) Đƣờng 1 : Nồng độ Cloxacillin 60mg/L
Đƣờng 2 : Nồng độ Cloxacillin 80mg/L Đƣờng 3 : Nồng độ Cloxacillin 100mg/L Đƣờng 4 : Nồng độ Cloxacillin 120mg/L Đƣờng 5 : Nồng độ Cloxacillin 140mg/L
30
Hình 3.11. PĐHTĐ của dung dịch AMO nồng độ (60 – 140 mg/L) với số chia CLO 60 mg/L
Đƣờng 1 : Nồng độ Amoxicillin 60mg/L Đƣờng 2 : Nồng độ Amoxicillin 80mg/L Đƣờng 3 : Nồng độ Amoxicillin 100mg/L Đƣờng 4 : Nồng độ Amoxicillin 120mg/L Đƣờng 5 : Nồng độ Amoxicillin 140mg/L
- Với AMO: Lấy phổ hấp thụ của hỗn hợp chứa CLO 100 mg/L và AMO (60 – 140 mg/L) chia cho phổ hấp thụ của CLO 60 mg/L, sau đó xử lí PĐHTĐ bằng chức năng smooth lấy đạo hàm bậc nhất của PĐHTĐ, rồi xử lí PĐHTĐ bằng chức năng smooth. Bƣớc sóng định lƣợng đƣợc xác định qua sự trùng lặp phổ đạo hàm tỉ đối của AMO 100 mg/L và hỗn hợp AMO 100 mg/L + CLO 100 mg/L. Qua khảo sát nhiều bƣớc sóng chúng tôi lựa chọn bƣớc sóng định lƣợng là 266,2 nm vì đây là bƣớc sóng có tín hiệu đạo hàm lớn nhất.
31
- Với CLO: Lấy phổ hấp thụ của hỗn hợp AMO 100,0 mg/L và ClO (60 – 140 mg/L) chia cho phổ hấp thụ của AMO 60 mg/L, sau đó tiến hành tƣơng tự nhƣ đối với AMO. Qua khảo sát nhiều bƣớc sóng chúng tôi lựa chọn bƣớc sóng định lƣợng là 258,0 nm vì đây là bƣớc sóng cho tín hiệu đạo hàm lớn nhất khi phổ CLO 100 mg/L trùng lặp với phổ hỗn hợp AMO 100 mg/L + CLO 100 mg/L.
Hình 3.12. PĐHTĐ của dung dịch CLO nồng độ (60-140 mg/L) với số chia AMO 60 mg/L
Đƣờng 1: Nồng độ Cloxacillin 60mg/L với số chia Amoxicillin 60mg/L Đƣờng 2: Nồng độ Cloxacillin 80mg/L với số chia Amoxicillin 60mg/L Đƣờng 3: Nồng độ Cloxacillin 100mg/L với số chia Amoxicillin 60mg/L Đƣờng 4: Nồng độ Cloxacillin 120mg/L với số chia Amoxicillin 60mg/L Đƣờng 5: Nồng độ Cloxacillin 140mg/L với số chia Amoxicillin 60mg/L
3.1.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính trong khoảng nồng độ dung dịch làm việc.
- Theo nồng độ dung dịch AMO và CLO chúng tôi pha là 100mg/L nên chúng tôi khảo sát khoảng tuyến tính sao cho nồng độ 100 mg/L nằm giữa đƣờng
32
chuẩn. Bởi vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính PĐHTĐ của AMO tại bƣớc sóng 266,2nm và của CLO tại bƣớc sóng 258,0nm cũng nhƣ PĐH của CLO tại bƣớc sóng 258,7nm ở các nồng độ mẫu từ 60 mg/L đến 140 mg/L đƣợc kết quả nhƣ sau:
+ Phổ đạo hàm bậc nhất của CLO tại bƣớc sóng 258,7nm từ nồng độ 60mg/L đến 140mg/L :
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CLO. Nồng độ CLO
(mg/L)
40 60 80 100 120 140
Tín hiệu đạo
hàm -0.6870 -0.9330 -1.2310 -1.5260 -1.8600 -2.1570
Hình 3.13. Phổ đạo hàm bậc nhất của CLO tại bƣớc sóng 258,7 nm
+ Phổ đạo hàm tỉ đối số chia AMO tại bƣớc sóng 258 nm từ nồng độ 60 mg/L đến 140 mg/L
33
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của AMO. Nồng độ AMO
(mg/L)
60 80 100 120 140
Tín hiệu đạo hàm -8.245 -11.075 -14.076 -17.017 -20.247
Hình 3.14. Phổ đạo hàm tỉ đối số chia AMO tại bƣớc sóng 258 nm
Mối quan hệ giữa nồng độ của AMO, CLO với giá trị PĐH, PĐHTĐ tại các bƣớc sóng định lƣợng đƣợc biểu diễn trong Bảng 3.5.
34
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của các phƣơng pháp quang phổ UV-VIS.
Phƣơng pháp Hoạt chất Bƣớc sóng Khoảng tuyến tính (mg/L) Phƣơng trình hồi quy Hệ số Tƣơng quan (R) CLO 258,7 60 - 140 y = - 0,150x - 0,0156 - 0,9997 AMO 266,2 60 - 140 y = 0,1055x + 0,2635 0,9995 CLO 258,0 60 - 140 y = - 0,0954x + 0,1959 - 0,9998 Nhận xét:
Nhận thấy giá trị tuyệt đối của các hệ số hồi quy tuyến tính r của các đƣờng chuẩn trên đều nằm trong khoảng: 0,995 ≤ r ≤ 1. Do vậy, các đƣờng chuẩn dựng ở trên đều chấp nhận đƣợc.