- Viên nang Faclacin 2 của Công ty Cổ phần dƣợc phẩm Trung ƣơng I – Pharbaco với các đặc điểm sau:
+ Cloxacillin (dạng cloxacillin natri) : 250 mg + Amoxicillin (dạng Amoxicillin trihydrat) : 250 mg
+ Tá dƣợc: tinh bột sắn, bột talc, magnesi stearat vừa đủ cho 1 viên. - Chất chuẩn nghiên cứu
+ Amoxicillin trihydrat (VKNTW): Hàm lƣợng: 98,40% Độ ẩm: 13,20%. + Cloxacillin Natri (VKNTW): Hàm lƣợng: 98,30% Độ ẩm: 4,37%. - Dung môi và hoá chất khác.
+ Nƣớc cất 2 lần đƣợc xử lí loại bỏ ion. + Methanol dùng cho HPLC.
+ Kali dihydrophosphat (KH2PO4) loại tinh khiết phân tích. 2.2. THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
- Máy quang phổ hai chùm tia Unicam UV 300 (ThermoSpectronic) đƣợc kết nối với máy tính (chạy trên hệ điều hành Windows XP) với phần mềm chuyên dụng Vision 32.
Chế độ đo:
+ Start Lambda: 200 nm - Stop Lambda: 400 nm + Data Mode : Absorbance
+ Band width : 1,5nm
23 + Data Interval: Very high resolution - Cuvet thạch anh bề dày 1cm.
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 series DAD. Cột Apollo C18 (150mm4,6 mm, 5m).
- Máy lọc nƣớc Maxima Ultra pure water (ELga). - Cân phân tích Sartorius, độ đọc 0,0001g
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60 H.
- Các dụng cụ: bình định mức (25; 50; 100; 200; 250 ml), pipet chính xác: (1; 5; 10; 20; 25 ml), cốc có mỏ, đũa thuỷ tinh, phễu lọc, giấy lọc băng xanh.
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1. Xây đựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời AMO và CLO bằng các phƣơng pháp quang phổ UV-VIS và sắc ký lỏng hiệu năng cao phƣơng pháp quang phổ UV-VIS và sắc ký lỏng hiệu năng cao
Các phƣơng pháp quang phổ
- Chọn bƣớc sóng định lƣợng thích hợp để loại bỏ đƣợc ảnh hƣởng của các chất gây cản trở.
- Chọn khảo sát khoảng nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và tín hiệu đo.
- Kiểm tra độ lặp lại của phƣơng pháp. - Kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp.
Phƣơng pháp phân tích đối chứng: Phƣơng pháp HPLC. - Tiến hành phân tích trên thiết bị HPLC các điều kiện sau:
+ Thẩm định điều kiện sắc ký.
+ Chọn khoảng nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và giá trị diện tích pic.
24 + Kiểm tra độ lặp lại của phƣơng pháp. + Kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp.
2.3.2. Ứng dụng để định lƣợng đồng thời AMO và CLO trong viên nang Faclacin 2 Faclacin 2
- Tiến hành định lƣợng AMO và CLO trong cùng một mẫu bằng các phƣơng pháp:
+ Quang phổ tử ngoại UV-VIS (phổ đạo hàm, phổ đạo hàm tỉ đối) + Sắc ký lỏng hiệu năng cao
- So sánh kết quả của các phƣơng pháp đo quang đối với phƣơng pháp HPLC và rút ra nhận xét.
2.3.3. Xử lý kết quả thực nghiệm [3]
Sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ với tín hiệu đo (trong các phƣơng pháp đo quang) và diện tích pic (trong phƣơng pháp HPLC) đƣợc thiết lập bằng phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu với hệ số tƣơng quan của đƣờng chuẩn 0,990.
So sánh độ chính xác của các phƣơng pháp bằng test F và so sánh các giá trị trung bình bằng test t với khoảng tin cậy 95%.
Giá trị trung bình: n X X n i i 1 Độ lệch chuẩn: 2 n i i 1 X X S n 1 Phƣơng sai: n X X S n i i 1 2 2
Độ lệch chuẩn tƣơng đối: 100
X S RSD
25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AMO VÀ CLO
3.1.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
3.1.1.1. Các dung dịch chuẩn đơn chất và hỗn hợp
- Dung dịch chuẩn AMO: Cân chính xác khoảng 0,100g AMO chuẩn, pha với nƣớc cất vừa đủ trong bình định mức 100 ml để có dung dịch gốc AMO 1000 mg/L. Từ dung dịch gốc này pha thành dãy chuẩn có nồng độ 60 – 140mg/L
- Dung dịch chuẩn CLO: Cân chính xác khoảng 0,100g CLO chuẩn, pha với nƣớc cất vừa đủ trong bình định mức 100 ml để có dung dịch gốc CLO 1000 mg/L. Từ dung dịch gốc này pha thành dãy chuẩn có nồng độ 60 – 140mg/L
- Dung dịch hỗn hợp chuẩn AMO và CLO: Các dung dịch hỗn hợp chuẩn đều đƣợc pha từ các dung dịch gốc đơn chất đã nêu.
3.1.1.2. Mẫu tự tạo
Đƣợc chuẩn bị từ 2 dung dịch gốc AMO và CLO, và tá dƣợc gồm tinh bột sắn, bột talc, magnesi stearat theo đúng tỉ lệ của nhà sản xuất.
3.1.1.3. Dung dịch thử được pha từ viên nang của Công ty Cổ phần dược phẩm Trung ương I – Pharbaco.
- Cân 20 viên thuốc bằng cân phân tích, tính khối lƣợng trung bình của viên. - Cân chính xác một lƣợng bột viên tƣơng ứng với khoảng 0,050 g AMO và 0,050 g CLO hoà tan với khoảng 50 ml nƣớc cất, siêu âm 20 phút, lọc vào bình định mức 100 ml, rửa tủa 3 lần bằng nƣớc cất, mỗi lần khoảng 10ml. Thêm nƣớc tới vạch đƣợc dung dịch thử có nồng độ 500 mg/L. Lấy chính xác 5,00 ml dung dịch này cho vào bình định mức 25 ml, thêm nƣớc tới vạch đƣợc dung dịch thử có nồng độ 100 mg/L.
26
3.1.2. Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời Amo và Clo
Hình 3.8. Phổ hấp thụ của dung dịch AMO 100 mg/L, CLO 100 mg/L và hỗn hợp AMO 100 mg/L + CLO 100 mg/L
Đƣờng 1: dung dịch CLO 100mg/L + AMO 100mg /L Đƣờng 2: dung dịch CLO 100mg/L
Đƣờng 3: dung dịch AMO 100mg /L
Về nguyên tắc không thể tiến hành định lƣợng đồng thời AMO và CLO trong hỗn hợp hai thành phần bằng quang phổ tử ngoại do sự đan xen phổ (Hình 3.8). Để định lƣợng AMO và CLO trong chế phẩm bằng phƣơng pháp quang phổ
27
truyền thống phải tiến hành tách chiết riêng từng hoạt chất rồi đo quang ở bƣớc sóng thích hợp. Tuy nhiên, phƣơng pháp này thƣờng đòi hỏi kỹ thuật xử lý mẫu phức tạp và/hoặc tiêu tốn thời gian. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật phổ đạo hàm (PĐH, PĐHTĐ) đƣợc khảo sát cho phép định lƣợng đồng thời và trực tiếp AMO và CLO không qua giai đoạn chiết tách.
Theo Hình 3.8 khảo sát tính chất cộng tính của mật đô quang đối với dung dịch AMO, CLO có cùng nồng độ 100mg/L và hỗn hợp AMO- CLO cũng có nồng độ 100mg/L đƣợc thể hiện tại Phụ lục 01. Từ đó nhận thấy từ bƣớc sóng 200 nm đến 245 nm không thể hiện tính cộng tính của độ hấp thụ quang, tuy nhiên từ bƣớc sóng 245 nm đến bƣớc sóng 275 nm thể hiện đúng tính cộng tính khi mật độ quang của hỗn hợp AMO và CLO bằng tổng mật độ quang của dung dịch AMO với dung dịch CLO có cùng nồng độ.
3.1.2.1. Chọn bước sóng định lượng đồng thời Amoxicillin và Cloxacillin.
Theo lý thuyết, đối với phƣơng pháp PĐH và PĐHTĐ 2 yếu tố chính ảnh hƣởng đến kết quả là bƣớc sóng định lƣợng và các thông số của phép lấy đạo hàm, phép làm trơn phổ đồ.
Phƣơng pháp phổ đạo hàm
- Lấy đạo hàm bậc nhất của phổ hấp thụ của đơn chất CLO và AMO (60 - 140mg/L) từ bƣớc sóng 210nm đến 280nm và xử lí PĐH bằng chức năng smooth. Nhận thấy tại 2 bƣớc sóng 258,7nm và 271,6nm giá trị PĐH bậc nhất của AMO bằng 0, vì thế giá trị PĐH bậc nhất của hỗn hợp chỉ phụ thuộc vào giá trị PĐH bậc nhất của CLO (tức là chỉ phụ thuộc vào nồng độ CLO). Tuy nhiên tại bƣớc sóng 271,6nm giá trị PĐH của CLO nhỏ nên sai số định lƣợng lớn. Bƣớc sóng 258,7nm đƣợc chọn làm bƣớc sóng định lƣợng CLO. Trên PĐH bậc nhất chúng tôi không chọn đƣợc bƣớc sóng định lƣợng AMO.
28
Hình 3.9. PĐH bậc nhất của dung dịch AMO nồng độ (60 – 140 mg/L) Đƣờng 1 : Nồng độ Amoxicillin 60mg/L
Đƣờng 2 : Nồng độ Amoxicillin 80mg/L Đƣờng 3 : Nồng độ Amoxicillin 100mg/L Đƣờng 4 : Nồng độ Amoxicillin 120mg/L Đƣờng 5 : Nồng độ Amoxicillin 140mg/L
- Lấy đạo hàm bậc hai của phổ hấp thụ của 2 đơn chất AMO và CLO từ bƣớc sóng 210nm đến 280nm và xử lí PĐH bằng chức năng smooth. Nhận thấy tại 2 bƣớc sóng 264,3 nm và 268,9 nm giá trị PĐH bậc 2 của AMO và CLO bằng 0, vì thế giá trị PĐH bậc hai của hỗn hợp lần lƣợt tại hai bƣớc sóng này chỉ phụ thuộc vào giá trị PĐH bậc 2 của CLO và AMO. Tuy nhiên tại 2 bƣớc sóng này sai số định lƣợng là khá lớn do cƣờng độ tín hiệu nhỏ, nên chúng tôi không lựa chọn để định lƣợng AMO và CLO.
29
Hình 3.10. PĐH bậc 2 của dung dịch CLO nồng độ (60 – 140 mg/L) Đƣờng 1 : Nồng độ Cloxacillin 60mg/L
Đƣờng 2 : Nồng độ Cloxacillin 80mg/L Đƣờng 3 : Nồng độ Cloxacillin 100mg/L Đƣờng 4 : Nồng độ Cloxacillin 120mg/L Đƣờng 5 : Nồng độ Cloxacillin 140mg/L
30
Hình 3.11. PĐHTĐ của dung dịch AMO nồng độ (60 – 140 mg/L) với số chia CLO 60 mg/L
Đƣờng 1 : Nồng độ Amoxicillin 60mg/L Đƣờng 2 : Nồng độ Amoxicillin 80mg/L Đƣờng 3 : Nồng độ Amoxicillin 100mg/L Đƣờng 4 : Nồng độ Amoxicillin 120mg/L Đƣờng 5 : Nồng độ Amoxicillin 140mg/L
- Với AMO: Lấy phổ hấp thụ của hỗn hợp chứa CLO 100 mg/L và AMO (60 – 140 mg/L) chia cho phổ hấp thụ của CLO 60 mg/L, sau đó xử lí PĐHTĐ bằng chức năng smooth lấy đạo hàm bậc nhất của PĐHTĐ, rồi xử lí PĐHTĐ bằng chức năng smooth. Bƣớc sóng định lƣợng đƣợc xác định qua sự trùng lặp phổ đạo hàm tỉ đối của AMO 100 mg/L và hỗn hợp AMO 100 mg/L + CLO 100 mg/L. Qua khảo sát nhiều bƣớc sóng chúng tôi lựa chọn bƣớc sóng định lƣợng là 266,2 nm vì đây là bƣớc sóng có tín hiệu đạo hàm lớn nhất.
31
- Với CLO: Lấy phổ hấp thụ của hỗn hợp AMO 100,0 mg/L và ClO (60 – 140 mg/L) chia cho phổ hấp thụ của AMO 60 mg/L, sau đó tiến hành tƣơng tự nhƣ đối với AMO. Qua khảo sát nhiều bƣớc sóng chúng tôi lựa chọn bƣớc sóng định lƣợng là 258,0 nm vì đây là bƣớc sóng cho tín hiệu đạo hàm lớn nhất khi phổ CLO 100 mg/L trùng lặp với phổ hỗn hợp AMO 100 mg/L + CLO 100 mg/L.
Hình 3.12. PĐHTĐ của dung dịch CLO nồng độ (60-140 mg/L) với số chia AMO 60 mg/L
Đƣờng 1: Nồng độ Cloxacillin 60mg/L với số chia Amoxicillin 60mg/L Đƣờng 2: Nồng độ Cloxacillin 80mg/L với số chia Amoxicillin 60mg/L Đƣờng 3: Nồng độ Cloxacillin 100mg/L với số chia Amoxicillin 60mg/L Đƣờng 4: Nồng độ Cloxacillin 120mg/L với số chia Amoxicillin 60mg/L Đƣờng 5: Nồng độ Cloxacillin 140mg/L với số chia Amoxicillin 60mg/L
3.1.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính trong khoảng nồng độ dung dịch làm việc.
- Theo nồng độ dung dịch AMO và CLO chúng tôi pha là 100mg/L nên chúng tôi khảo sát khoảng tuyến tính sao cho nồng độ 100 mg/L nằm giữa đƣờng
32
chuẩn. Bởi vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính PĐHTĐ của AMO tại bƣớc sóng 266,2nm và của CLO tại bƣớc sóng 258,0nm cũng nhƣ PĐH của CLO tại bƣớc sóng 258,7nm ở các nồng độ mẫu từ 60 mg/L đến 140 mg/L đƣợc kết quả nhƣ sau:
+ Phổ đạo hàm bậc nhất của CLO tại bƣớc sóng 258,7nm từ nồng độ 60mg/L đến 140mg/L :
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CLO. Nồng độ CLO
(mg/L)
40 60 80 100 120 140
Tín hiệu đạo
hàm -0.6870 -0.9330 -1.2310 -1.5260 -1.8600 -2.1570
Hình 3.13. Phổ đạo hàm bậc nhất của CLO tại bƣớc sóng 258,7 nm
+ Phổ đạo hàm tỉ đối số chia AMO tại bƣớc sóng 258 nm từ nồng độ 60 mg/L đến 140 mg/L
33
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của AMO. Nồng độ AMO
(mg/L)
60 80 100 120 140
Tín hiệu đạo hàm -8.245 -11.075 -14.076 -17.017 -20.247
Hình 3.14. Phổ đạo hàm tỉ đối số chia AMO tại bƣớc sóng 258 nm
Mối quan hệ giữa nồng độ của AMO, CLO với giá trị PĐH, PĐHTĐ tại các bƣớc sóng định lƣợng đƣợc biểu diễn trong Bảng 3.5.
34
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của các phƣơng pháp quang phổ UV-VIS.
Phƣơng pháp Hoạt chất Bƣớc sóng Khoảng tuyến tính (mg/L) Phƣơng trình hồi quy Hệ số Tƣơng quan (R) CLO 258,7 60 - 140 y = - 0,150x - 0,0156 - 0,9997 AMO 266,2 60 - 140 y = 0,1055x + 0,2635 0,9995 CLO 258,0 60 - 140 y = - 0,0954x + 0,1959 - 0,9998 Nhận xét:
Nhận thấy giá trị tuyệt đối của các hệ số hồi quy tuyến tính r của các đƣờng chuẩn trên đều nằm trong khoảng: 0,995 ≤ r ≤ 1. Do vậy, các đƣờng chuẩn dựng ở trên đều chấp nhận đƣợc.
3.1.3. Độ lặp của phƣơng pháp
Chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp của của các phƣơng pháp đo quang dựa vào kết quả thống kê sau 6 lần định lƣợng đồng thời AMO và CLO với một mẫu chế phẩm.
PĐH
35
Bảng 3.6. Độ lặp của các phƣơng pháp quang phổ UV-VIS (Lô 010808)
Lƣợng cân (g)
Hàm lƣợng X (mg/viên)
PĐH PĐHTĐ
CLO AMO CLO
0,1207 255,03 247,81 257,53 0,1174 257,82 250,03 259,47 0,1155 254,89 244,14 258,89 0,1163 258,07 245,01 261,42 0,1181 256,41 247,20 256,44 0,1171 255,31 248,09 25,96 TB X 256,26 247,05 258,13 SD 1,42 2,15 2,31 RSD (%) 0,6 0,9 0, 9 . Nhận xét:
Nhận thấy giá trị RSD <2% do vậy phƣơng pháp nghiên cứu đạt yêu cầu về độ lặp.
36
3.1.4. Độ đúng của các phƣơng pháp
- Đƣợc xác định thông qua phần trăm tìm lại của hỗn hợp mẫu tự tạo AMO 100mg/L và CLO 100mg/L bằng phƣơng pháp quang phổ (bảng 3.7).
Bảng 3.7. Kết quả định lƣợng hỗn hợp mẫu tự tạo AMO 100mg/L và CLO 100mg/L bằng các phƣơng pháp quang phổ
STT
Phần trăm tìm lại (%)
PĐH PĐHTĐ
CLO AMO CLO
1 99,52 100,71 99,81 2 99,82 99,67 99,06 3 100,5 100,97 100,48 4 99,1 99,99 100,02 5 99,35 100,12 100,86 6 99,6 100,03 99,12 TB X 99,65 100,24 99,89 SD 0,48 0,49 0,72 RSD (%) 0,5 0,5 0,7 Nhận xét:
Nhận thấy giá trị RSD <2% do vậy phƣơng pháp nghiên cứu đạt yêu cầu về độ đúng.
37
3.2. PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
3.2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,100g chất chuẩn AMO và 0,100g chất chuẩn CLO, pha với dung môi pha động vừa đủ trong bình định mức 100ml đƣợc dung dịch gốc có nồng độ mỗi chất là 1000 mg/L. Từ dung dịch gốc này pha thành dãy chuẩn có nồng độ 60 – 140 mg/L. Lọc qua màng lọc 0,45m.
Dung dịch thử:
- Cân 20 viên thuốc bằng cân phân tích, tính khối lƣợng trung bình của viên. - Cân chính xác một lƣợng bột viên tƣơng ứng với khoảng 0.050 g AMO và 0,050 g CLO hoà tan với pha động, siêu âm 10 phút, lọc vào bình định mức 100 ml, rửa tủa 3 lần bằng pha động, mỗi lần khoảng 10 ml. Thêm pha động tới vạch đƣợc dung dịch thử có nồng độ 500 mg/L. Lấy chính xác 5,00 ml dung dịch này cho vào bình định mức 25 ml, thêm pha động tới vạch đƣợc dung dịch thử có nồng độ 100 mg/L. Lọc qua màng lọc 0,45 m
3.2.2. Kiểm tra lại phƣơng pháp sắc ký lỏng áp dụng tại Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Trung ƣơng 1 Dƣợc phẩm Trung ƣơng 1
3.2.2.1. Điều kiện sắc ký đang áp dụng
Điều kiện sắc ký đƣợc lựa chọn theo qui trình hiện hành đang áp dụng tại Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Trung ƣơng 1 nhƣ sau:
Cột : Apollo C18 (150 mm 4,6 mm, 5 m)
Pha động : dung dịch Kali dihydrophosphat 0,01M : Methanol (45 : 55)
Tốc độ dòng : 1 ml/phút
Detector : 225 nm.
38
Hình 3.15. Sắc kí đồ tách 2 chất AMO 100 mg và CLO 100 mg
3.2.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính của khoảng đo
- Chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính của AMO và ClO trong điều kiện sắc ký đã chọn, nồng độ các mẫu từ 60 mg/L đến 140 mg/L đƣợc kết quả nhƣ sau.
+ Đối với AMO :
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của AMO 100mg/L. Nồng độ AMO
(mg/L)
60 80 100 120 140