2.2.2.I. Dinh tinh câc nhôm chat bàng phân ûng hoâ hoc:
Chuan bi dung diçh thit.Duoc liêu duoc phân loai riêng lâ, hoa, thân, rê. - Chiét duoc liêu bàng ether dâu, cô dich chiét dén tÿ le 1:1. Dich chiét ether dâu dë dinh tmh dâu béo, sterol, carotenoid.
- Bâ sau chiét ether dâu chiét bàng chloroform, cô dich chiét dén tÿ le 1:1 duoc dung dich dinh tmh terpenoid.
- Bâ sau chiét chloroform duoc chiét côn dén kiêt, cô dich chiét dén tÿ lê 1:1. Dich chiét côn dë dinh tînh alcaloid, glycosid, saponin, flavonoid, coumarin, anthranoid.
- Bâ côn lai chiét nuôc duoc dung dich dinh tmh tanin, duông khir, acid hûu co.
1/ Dinh tinh Alcaloid:
Lây 3 ong nghiêm nhô, phân vào môi ong 1 ml dich chiét côn cûa lâ.
a/ r
- Ong 1: Nhô vài giot thuôc thir Mayer: xuât hiên tüa trâng (phàn ung duong tmh).
A/
- Ong 2: Nhô vài giot thuôc thuf Bouchardat: xuât hiên tüa nâu (phàn ûng duong tmh).
A/
- Ong 3: Nhô vài giot thuôc thü Dragendorff: xuât hiên tüa dô cam (phân üng duong tmh).
Tién hành tuong tu nhu trên vôi câc mâu hoa, thân, rê. Kê't quâ cho thây câc phàn üng dêu duong tmh.
So bô kêt luân: trong cây Parthenium hysterophorus cô alcaloid ô tât câ câc bô phân.
2/ Dinh tinh Glycosid tim:
Lây 6 ong nghiêm nhô, phân vào môi ong 1 ml dich chiét côn.
acetic, làc dêu cho cân tan hét. Nghiêng thành ong nghiêm 45°, thêm dông luong acid sulfuric dâc theo thành ong dé dich lông trong ong nghiêm chia thành 2 lôp.
Kët quâ: Ô mât tiép xüc giüa 2 lôp chât lông câ mâu lâ, hoa, thân, rê dêu không thây cô vong tim dô (phân ung âm tmh).
b. Phân ûng Légal: ong nghiêm 2: Nhô 1 giot thuôc thü Natrinitroprussiat 0,5 % và 2 giot dung dich Natrihydroxyd 10%. Làc dêu.
Kët qud:Lâ, hoa xuât hiên màu hông (phân üng duong tmh);
Thân, rê không thây xuât hiên màu hông (phân üng âm tmh).
c. Phdn ûng Baljet: ong nghiêm 3: Thêm vài giot thuôc thü picrosodic môi pha gôm 9,5 ml dung dich acid picric 1 % và 0,5 ml dung dich natrihydroxyd.
Kët qud: Cà lâ, hoa, thân rê dêu thây xuât hiên màu dô cam (phàn üng duong tmh).
d. Phdn ûng Kedde: ong nghiêm 4: Nhô vài giot thuôc thü môi pha gôm 2 ml dung dich acid 3,5 dinitrobenzoic 2 % trong côn, 2 ml dung dich Kalihydroxyd và 2 ml nuôc.
Kët qud: Lâ, hoa cho màu hông, thân rê cho màu tim (phân üng duong tmh).
e. Phân üng Keller-Kiliani: ông nghiêm 5: Bôc hüi dén khô, hoà tan nông cân trong ông nghiêm vôi 3 ml acid acetic và 1 giot Sât (III) chlorid 5 %, làc dêu. Nghiêng ông nghiêm 45°, thêm dông luong acid sulfuric dâc theo thành ông nghiêm, de phân lôp.
Kët quâ: Ô mât ngân câch giüa 2 lôp châ't lông câ lâ, hoa, thân, rê dêu không thây xuât hiên vong tim dô (phân üng âm tmh).
/. Phân ûng vôi thuoc thüXanthydrol: ông nghiêm 6: Bôc hoi dén khô, thêm 1 ml thuôc thü Xanthydrol. Dun câch thuÿ ông nghiêm soi 3 phüt.
Kët quâ: Câ lâ, hoa, thân, rê dêu không thây xuâ't hiên màu dô (phân üng âm tmh).
Sa bô két luân: toàn cây không cô Glycosid tim.
3! Dinh tmh Saponin:
a. Hiên tuçfng tao bot: Lây 1 ml dich chiét côn vào 1 ông nghiêm lôn , thêm 5 ml nuôc cât, làc manh trong 15 giây thây tao bot bên sau 10 phüt. Thêm 1-2 giot acid hydrochloric, bot vân bên.
Phân biêt Saponin steroid và Saponin triterpenoid:
Bô tri thf nghiêm trong 2 ông nghiêm nhu sau:
Bâng 2: Tao bot à pH khâc nhau
A7
Ong nghiêm 1 Ong nghiêm 2
Dich chiét duac lieu 1 ml 1 ml
Dung dich NaOH 0,1N (pH=13) 5 ml 0 ml
Dung dich HC1 0,1N (pH=l) 0 ml 5 ml
Làc manh ông nghiêm trong 15 giây Hiên tuang tao bot
(Lâ, hoa, thân, rê)
Côt bot cao Côt bot thâ'p
Sa bô kêt luân: Trong cây Cüc liên chi dai cô Saponin steroid.
b. Phân ûng phâ huyê't trên lam kînh:
Chuan bi dich mâu 0.2% (dà loai fibrin): trôn 1 thé tich Natri-citrat 4% vôi 9 thé tich mâu thô tuai. Bào quàn à 2°C-4°C (mâu thô dâ loai fibrin). Lây 40ml dung dich natri chlorid 0.9% vào bïnh dinh müc 100ml. Thêm chmh xâc 2ml mâu dâ loai fibrin, lâc nhe. Thêm dung dich Natri chlorid 0.9% vira dû 100ml, lâc kÿ.
Tien hành phân ûng: cho vào ông nghiêm 2ml dich chiét côn, cô thành cân, hoà tan cân trong 1ml dung dich natri chlorua 0.9% duoc dich thu. Nhô 1 giot dich mâu 0.2% lên phién kmh. Dây lâ kmh. Soi duôi kïnh hiën vi vât kmh 10 dë quan sât hông câu ô trang thâi bïnh thuông. Nhô 1 giot dich thü vào mép lâ kmh. Mép dôi diên dùng giây loc hüt nuôc duôi lâ kmh. Quan sât duôi kfnh hiën vi ta thây hông câu bi vô dàn (phân üng duang tinh).
Dich chiét côn phân vào câc ong nghiêm, lâ, hoa, thân, rê môi mâu 2 ong, môi ong 2 ml roi cô câch thuÿ dë làm câc phân ring:
- Phân ûng Liebermann-Bouchardat: Hoâ tan nông cân trong 1 ml anhydrid acetic, thêm 1 giot acid sulfuric dâc.
Két quâ: Lâ: xuât hiên mâu xanh thâm; Hoa: xuât hiên mâu xanh lue Thân: xuât hiên mâu vàng nâu; Rê: xuât hiên mâu vàng nâu - Phân ûng Salkovski: Nhô vài giot acid sulfuric dâc vào cân.
Lâ, Hoa: xuâ't hiên màu nâu Thân, Rê: xuât hiên màu nâu dô
Sa bô két luân: Cüc liên chi dai cô Saponin àtât câ câc bô phân
4/ Dinh tmh Flavonoid: a. Phân ûng vôi Kièm:
- Nhô 1 giot dich chiét côn lên giây loc, dë khô, ha lên miêng lo amoniac dâc.
Két quâ: Lâ, Hoa, Thân: màu vàng tâng lên (phân üng duang tmh) Rê: không màu (phân üng âm tmh)
- Phân üng vôi NaOH 10%: 1ml dich chiét côn thêm vài giot dung dich NaOH 10%.
Két quâ: Lâ: cô két tüa vàng (phàn üng duang tmh)
Hoa, Thân: tüa tan ngay, màu vàng tâng (phân üng duang tmh). Rë: không thây tüa, màu vàng không tâng (phân üng âm tmh).
b. Phân ûng vâi Sât (III) chlorid 5%: 1 ml dich chiét côn thêm vài giot dung dich FeCl3 5%.
Két quâ: Lâ, Hoa: màu xanh den (phân üng duong tmh); Thân: vàng xanh; Rê: vàng (phân üng âm tmh).
c. Phân ûng Cyanidin: 1 ml dich chiét côn thêm mot ît bôt Mg (Zn) kim loai, nhô 3-5 giot HC1 dâc. Dun câch thuÿ vài phüt.
Két quâ: Lâ: màu nâu; Hoa: nâu dô (phàn üng duang tmh); Thân, Rê: không màu (phân üng âm tmh).
Sa bô két luân: Lâ, hoa cô flavonoid; Thân, rê không cô flavonoid.
5/ Dinh tinh Coumarin:
a. Phân ûng mô dông vong lacton:
- Lâ'y 2 ong nghiêm, môi ông 1 ml dich chiêt côn Ông 1: thêm 0,5 ml dung dich NaOH 10%
A? 9
Ong 2: dê nguyën
Dun câ 2 ông dén soi, dé nguôi. Quan sât:
Lâ Hoa Thân Rê
Ô ng 1 Tüa vàng duc màu vàng duc màu vàng duc màu trâng duc
Ô ng 2 trong trong trong màu trâng duc
- Thêm vào câ 2 ông, môi ông 2 ml nuôc cât, lâc dêu. Quan sât:
Lâ Hoa Thân Rê
Ô ng 1 trong trong trong trong
Ô ng 2 tüa duc duc duc trong
- Thêm vào ông 1 vài giot HC1 dâc. Quan sât:
Lâ Hoa Thân Rê
Ô ng 1 duc duc duc duc
Ô ng 2 duc duc duc duc
♦ b. Phân ûng vôi thuoc thü diazo:
1 ml dich chiét côn thêm 2 ml dung dich natrihydroxyd 10%, dun câch thuÿ dén sôi roi de nguôi. Nhô vài giot thuôc thur diazo.
Kët quâ: Lâ, Hoa, Thân: không xuàt hiên màu dô gach (phân img âm tmh). Rê: màu vàng cam (phân ung âm tmh).
Sa bô két luân: Toàn cây không cô coumarin.
- Phân ûng Borntraeger: Lâ'y 1ml dich chiét côn, thêm 1ml amoniac, lâc nhe.
Két quai Câ lâ, hoa, thân, rê: Lôp chloroform không màu, lôp nuôc không thây màu dô sâm (phàn üng âm tmh).
- Phân ûng vi thâng hoa: Cho bôt duoc liêu vào nàp kim loai, phia trên cô dây bàng mot tâm kmh, trên tâm kmh cô dë bông tâm uôt. Ho nàp kinh trên ngon lira dèn côn trong vài phüt. Lây tâm kinh, dë nguôi. Dem soi duôi kmh hiën vi.
Két quâ: Không thây tinh thë hinh kim màu vàng (phân üng âm tmh)
Sa bô két luân: Cây không cô Anthranoid.
71 Dinh tinh Tanin:
Lây 4 ong nghiêm nhô, phân vào môi ong 1ml dich chiét nuôc.
a. Phân ûng vôi Gelatin:
a/ ^
Ong 1: Nho 1-2 giot dung dich gelatin 1 %.
Két quâ: Cà hoa, lâ, thân, rë dêu không thây xuât hiên tüa bông trâng (phân üng âm tmh).
b. Phân ûng vôi Sat (III) chlorid 5%:
Ong 2: Nhô 1-2 giot FeCl3 5%.
Két quâ: Lâ, Hoa: cô tüa xanh den (phân üng duong tmh), cô thë do su cô mât cüa mot sô nhôm hop chat mà trong phân tu cô nhiêu nhôm - OH.
Thân, Rê: không xuâ't hiên tüa (phân üng âm tmh).
c. Phân ûng vôi Pb(CH3COO)2 10%:
Ong 3: Nhô 1-2 giot Pb (CH3COO)2l() %
Két quâ: Lâ, Hoa, Thân: không xuâ't hiên tüa bông (phân üng âm tmh). Rê: cô tüa bông (phàn üng duong tmh).
d. Phân ûng vôi Cu(CH3COO)2 10%:
Ong 4: Nhô 1-2 giot Cu(CH3COO)2 10%.
Két quâ: Lâ, Hoa, Thân: không xuâ't hiên tüa (phân üng âm tmh). Rê: cô tüa (ît) (phân ung duong tmh)..
Sa bô két luân: Cây không cô Tanin.
8/ Dinh tmh Sterol:
Dich chiét ether dàu phân vào 2 ông nghiêm, môi ông 2 ml. Bôc hoi dén cân.
a. Phân ûng Salkovski: Cho vào ông nghiêm chira cân 2 ml chloroform, lâc cho tan hét cân. Nghiêng thành ông nghiêm 45° roi thêm tir tir 1 ml acid sulfuric dâc doc theo thành ông dé dich lông phân thành 2 lôp.
Két quâ: Câ lâ, hoa, thân, rê: ô mât tiép xüc giûa 2 lôp chât lông cô màu nâu dô, lôp chât lông bên trên chuyën sang màu vàng xanh (phân ûng duong tmh).
b. Phân ûng Liebermann: Cân khô trong ông nghiêm duoc hoà tan trong 1 ml anhydrid acetic. Nghiêng thành ông nghiêm 45° roi thêm tir tù theo thành ông 1 ml acid sulfuric dâc, dich lông trong ông nghiêm phân thành 2 lôp.
Két quâ: Cà lâ, hoa, thân, rê: bê mât phân câch xuât hiên vông tîm dô (phàn ûng duong tmh).
Sa bô két luân: Cây cô Sterol.
91 Dinh tmh terpenoid:
Lây 6 ông nghiêm nhô, phân vào môi ông 1 ml dich chiét chloroform. Bôc hai dén khô de làm câc phàn ung sau:
/v'
a. Phân ûng vôi Hydroxymat feric: Ong 1: Hoà trong ethanol, thêm 1 giot dung dich Hydroxylamin clohydrat 2N, 1 giot KOH 2N trong MeOH. Dun câch thuÿ 1-2 phüt. De nguôi. Acid hoa bàng 1-2 giot HC1 N, thêm 1 giot FeCl3 1 %.
Két quâ:_Lâ, hoa: xuât hiên màu dô tia (phân ung duong tmh). Thân: xuât hiên màu hông (phân ung duong tmh yéu). Rê: không màu (phàn ung âm tmh).
b. Phân ûng Légal: Ong 2: thêm 1 ml ethanol 90°, lâc dêu. Nhô 1 giot thuôc thu* Natrinitroprussiat 0,5 % và 2 giot dung dich Natrihydroxyd 10%. Lâc dêu.
Rê không thây xuât hiên màu hông (phân üng âm tmh).
9 '
c. Phan ûng Baljet: Ong 3: thêm 1 ml ethanol 90°, làc dêu. Thêm vài giot thuôc thir picrosodic môi pha gôm 9,5 ml dung dich acid picric 1 % và 0,5 ml dung dich natrihydroxyd.
Két quâ: Cà lâ, hoa, thân rê dêu thây xuât hiên màu dô cam (phân üng duong tmh).
d. Phân ûng Kedde: Ông 4: Hoà tan cân vôi 1 ml ethanol 90°. Nhô vào dô vài giot thuôc thu" môi pha gôm 2 ml dung dich acid 3,5 dinitrobenzoic 2 % trong côn, 2 ml dung dich Kalihydroxyd và 2 ml nuôc.
Két quâ: Lâ, hoa cho màu hông, thân rê cho màu tim (phàn üng duong tmh).
A/
e. Phân ûng khüTollens: Ong5: Hoà tan cân vôi 1 ml ethanol 90°. Thêm 5-6 giot AgN03 trong NH4OH. Dun câch thuÿ 1-2 phüt.
Két quâ: Lâ, Hoa, Thân, Rê: Trên thành ông nghiêm dêu cô Ag giâi phông (phân üng duong tmh).
/. Phân ûng vôi Vanilin phosphoric: Ong 6: Hoà tan cân vôi 1 ml methanol 80°. Thêm 1-2 giot thuôc thir Vanilin phosphoric 1 %.
Két quâ: Lâ, hoa, thân: xuât hiên màu nâu tim (phân üng duong tmh) Rê: màu vàng (phân üng âm tmh).
Sa bô két luân: Lâ, Hoa, Thân cô Terpenoid. Rê không cô Terpenoid.
101 Dinh tinh acid hüu cff:
Lây 1 ml dich chiét nuôc, cô dén cân. Hoà cân trong 1 ml nuôc cât, thêm 1 ft Natricarbonat.
Két quâ: Lâ, hoa, thân, rê: dêu cô bot khi (phàn üng duong tinh)
Sa bô két luân : Cây cô acid hüu c o.
/ / / Dinh tinh ditùng: a. Duông khû tu do:
Lây 2ml dich chiét nuôc, thêm 1ml thuoc thü Fehling A và 1ml thuoc thvr Fehling B, dun câch thuÿ soi 5 phüt.
Két quâ: Lâ, hoa, thân, rê: dêu cô tûa dô gach (phân üng duong tmh).
Sa bô két luân: Cây cô duông khû tu do.
b. Polysaccharid:
- Dich chiét nuôc thêm vài giot thuôc thir xanh methylen 0,15 % trong côn.
Két quâ: Lâ, hoa, thân, rë: không xuât hiên tüa xanh. - Nhô vài giot côn 60° vào dich chiét nuôc.
Két quâ: Lâ, hoa, thân, rê: không xuât hiên tüa bông (phân üng âm tmh)..
Sa bô két luân: Cây không cô Polysaccharid.
121 Dinh tinh phàn dâu béo:
- Chat béo: Nhô 1 giot dich chiét ether dâu lên giây loc hoâc giây bông kmh, ho khô.
Két quâ: Lâ, rê: dë lai vét mô. Hoa, Thân: không dë lai vêt mô.
Sa bô két luân:_ Lâ, rê: cô chât béo. Hoa, thân: không cô chat béo.
- Carotenoid: 5 ml dich chiét ether dâu cô dén cân. Thêm 1 ml acid sulfuric dâc.
Két quâ: Lâ, hoa, thân: xuât hiên màu xanh. Rê: không cô màu xanh.
Sa bô két luân: Lâ, hoa, thân: cô carotenoid. Rê: không cô carotenoid.
2.22.2. Dinh tmh mot so nhôm chât bàng sâc ky lâp mông: 1/ Saponin:
- Dung dich châm sâc kÿ: lg bôt duoc liêu (lâ, hoa) chiét Soxhlet vôi ether dâu dë loai chât béo rôi chiét vôi hôn hop methanol-nuôc (4:1). Câ't thu hôi methanol, hoà tan cân trong nuôc dë cô dung dich 10% rôi lâc vôi n-butanol. Tâch lôp n-butanol, lâc lôp n-butanol nhiêu làn vôi nuôc dë loai tap. Cât thu hôi n-butanol. Hoà tan cân vôi 1 ml methanol dë cô dung dich châm sâc kÿ. - Dung môi khai triën: n-butanol: acid acetic bâng: nuôc (5:1:4) (lôp trên). - Thuôc thir hiên màu: Vanilin phosphoric 1 % trong methanol.
Sau khi khai triën, de khô bàn mông ô nhiêt dô phông, phun thuôc thu, sây bân mông ô 105°C dén khi hiên rô vét.
Trên sâc kÿ dô cüa cà lâ và hoa xuât hiên 2 vêt màu tim sâm cô Rf = 0,51 và 0,4; 1 vét màu tim nhat cô Rf = 0,28 (Hinh 5).
2/ Flavonoid:
- Dung dich châm sâc kÿ: lg duoc lieu (lâ, hoa) chiét vôi ether dàu bàng Soxhlet de loai chât béo roi chiét vôi Methanol. Cô dich methanol tôi khô. Cân hoà 0,5 ml methanol de châm sâc kÿ.
Châm 20|j,l dich methanol cüa lâ và hoa trên bàn mông 5x15. - Dung môi khai triën: chloroform : methanol (85:15).
- Thuôc thü hiên màu: Soi UV; Sât (III) chlorid 5% trong MeOH
Bân mông sau khi triën khai sây khô, soi UV, sau dô phun thuôc thü Sât (III) chlorid, trên sâc kÿ dé xuât hiên câc vét nhu sau:
Vét
Lâ Hoa
Soi UV Sât (III) chlorid Soi UV Sât (III) chlorid
Màu R f Màu Màu R f Màu
1 Lo 0,67 Xanh den Lo 0,62 Xanh den
2 Lo 0,52 Xanh den Lo 0,53 Xanh den
3 Lo 0,41 Xanh thâm Lo 0,42 Xanh thâm
3/ Terpenoid:
- Dung dich châm sâc kÿ: Chiét lg duoc lieu (lâ, hoa) bàng chloroform (Soxhlet). Dich chloroform loai tap bàng chi acetat 5 % trong côn loâng, loc. Dich loc thu hôi chân không dén hét côn roi làc vôi chloroform. Lây dich chloroform, thu hôi dung môi. Cân thu duoc hoà tan trong chloroform.
Châm 20ja.l dich chloroform cüa lâ và hoa trên bân mông 5x15. - Dung môi khai triën: n-hexan : ethylacetat (2: 8).
- Thuôc thü hiên màu: hoi Iod
Bân mông sau khi khai triën, dé khô à nhiêt dô phong, dât trong bînh bao hoà Iod tùf 10-15’. Trên sàc kÿ dô, cà lâ và hoa dèu xuât hiên vêt màu vàng cam côR f = 0,39.
• •
M »
a b
Hinh 5: Sâc kÿ dô SKLM dinh tinh Hinh 6: Sâc kÿ dô SKLM dinh tinh
Saponin trong lâ và hoa Terpenoid trong lâ và hoa
a: Dich chiê't lâ a: Dich chiê't lâ
b: Dich chiê't hoa b: Dich chiét hoa
Kët quâ dinh tmh câc nhôm chât chmh trong cây Parthenium hysterophorus L. bàng phân ûng hoâ hoc diïçrc thé hiên à Bàng 3
Bàng 3: Két quâ dinh tmh câc nhôm chât chinh trong cây P. hysterophorus
STT Phân urng dinh tmh Lâ Hoa Thân Rê So bô kêt luân
1 Alcaloid:
- PU* vôi TT Mayer + + + + Lâ, hoa, thân, rê- PU* vôi TT Bouchardat + + + ++ dèu cô alcaloid. - PU* vôi TT Bouchardat + + + ++ dèu cô alcaloid.
- PU vôi TT Dragendorff ++ + + +