D. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của công trình
3.2. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men
NẤM MEN S. cerevisiae M2 TRONG MÔI TRƢỜNG NHÂN GIỐNG
Trong quá trình sản xuất rượu vang, giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn khoảng 24 – 28h nhưng lại có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lượng tế bào nấm men. Việc nghiên cứu động thái sinh trưởng, phát triển của chủng S.cerevisiae M2 là một phần trong quá trình sản xuất rượu vang.
Để xác định động thái phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M2, tiến hành cấy giống vào môi trường 2. Môi trường nhân giống được khử trùng bằng K2S2O5 ( chứa 55% SO2 ) với hàm lượng 50mg/l, số lượng tế bào ban đầu là 3x106
tế bào/ml, nuôi trên máy lắc 150 vòng/phút ở 280C. Sau 6h lại kiểm tra số lượng tế bào một lần. Kết quả được biểu thị ở đồ thị 3.1.
0 50 100 150 200 250 0h 6h 12h 18h 24h 30h 36h 42h 48h Thời gian (1 ) (1): Số lượng tế bào x 106
Đồ thị 3.1. Động thái phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M2 trong môi trƣờng nhân giống
Qua đồ thị ta thấy số lượng tế bào trong 6h đầu tăng chậm. Lượng tế bào tăng nhanh từ 12h đến 24h. Từ 24h đến 30h số lượng tế bào tăng chậm, ổn định và đạt giá trị cực đại. Từ 36h đến 48h số lượng tế bào bắt đầu giảm. Sở dĩ trong 6h đầu số lượng tế bào tăng chậm là do đây là thời gian nấm men làm quen với môi trường, một số nấm men không đề kháng được với SO2 sẽ bị tiêu diệt. 6h đầu nấm men sinh sản là chủ yếu. Từ 6h đến 24h, nấm men thực
hiện quá trình trao đổi chất để sinh trưởng nên số lượng tế bào tằg nhanh. Khi nguồn dinh dưỡng giảm thì số lượng tế bào có tăng nhưng không đáng kể, ứng với thời điểm từ 24h đến 30h. Và khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, nấm men không có dinh dưỡng để sinh trưởng và sinh sản nên bị chết dần, đó là thời điểm 30h đến 48h. Như vậy, quá trình sinh trưởng của chủng S.cerevisiae
M2 có thể chia thành 4 giai đoạn:
Giai đoạn từ 0h đến 6h ứng với pha tiềm phát. Giai đoạn từ 6h đến 24h ứng với pha logarit. Giai đoạn từ 24h đến 30h ứng với pha cân bằng. Giai đoạn từ 30 giờ đến 48h ứng với pha suy vong.
Mục đích thí nghiệm là xác định thời điểm số lượng tế bào đạt cực đại để chọn được thời gian nhân giống thích hợp. Từ kết quả trên tôi xác định thời gian từ 24h đến 28h là thời gian nhân giống thích hợp nhất. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của các tác giả khác như Đinh Thị Kim Nhung, Đoàn Văn Tân, Nguyễn Quang Thảo khi nghiên cứu về đặc điểm sinh trưởng, phát triển của Saccharomyces cerevisiae trong nghiên cứu quá trình nhân giống của nó.
3.3. NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TỚI SỰ
PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG S.cerevisiae M2
Mục tiêu chính là tìm ra điều kiện môi trường nhân giống tối ưu nhất để chủng S.cerevisiaeM2 có thể sinh sản đạt số lượng tế bào nhiều nhất với chất lượng tốt nhất để đáp ứng quá trình lên men vang.
3.3.1. Ảnh hưởng của pH tới quá trình nhân giống
Tiến hành cấy chủng nấm men S.cerevisiae M2 vào môi trường nhân giống ở các độ pH khác nhau với số lượng ban đầu là ( 3x106 ) tế bào/ml, ở nhiệt độ 28-30oC trong các bình tam giác 100ml trên máy lắc 150 vòng/phút trong khoảng thời gian 24h.
Tiến hành đếm số lượng tế bào. Kết quả được thể hiện ở đồ thị sau: 0 10 20 30 40 50 60 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 pH (1 ) (1): số lượng tế bào x 106
Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của pH tới quá trình nhân giống chủng nấm men S.cerevisiae M2
Nhìn vào đồ thị ta thấy chủng S.cerevisiae M2 sinh sản và phát triển tốt trêm môi trường nhân giống có độ pH = 4 - 4,5. Ở các giá trị pH khác, chủng nấm men S. cerevisiae M2 sinh sản yếu ớt và khi môi trường có pH cao thì dễ bị nhiễm khuẩn.
Như vậy, pH thích hợp cho quá trình nhân giống là 4 - 4,5.
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình nhân giống
Chủng nấm men S.cerevisiae M2 được cấy vào môi trường nhân giống ở pH = 4, nuôi trên máy lắc 150vòng/phút trong 30h ở các nhiệt độ khác nhau: 240C, 280C, 320C, 360C; hàm lượng giống ban đầu là 3.106tế bào/ml.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình nhân giống
(M.106±m tb/ml)
Nhiệt độ Thời gian (h)
0h 8h 16h 24h 30h 240C 3±1,2 12±1,1 59±1,3 165±1,1 170±1,0 280C 3±1,2 13±1,4 84±1,1 198±1,3 200±1,2 320C 3±1,2 15±1,0 90±1,0 185±1,1 190±1,1 360C 3±1,2 13±1,1 60±1,0 154±1,1 165±1,0
Tốc độ sinh trưởng của nấm men phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Sau 30h nuôi cấy thấy số lượng nấm men cao nhất ở nhiệt độ 280C-320C. Ở nhiệt độ trên 320C, tốc độ sinh trưởng của chủng M2 bị giảm, không phù hợp với quá trình sản xuất.
3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ tới quá trình nhân giống
Thí nghiệm xác định hàm lượng (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng S. cerevisiae M2 được thể hiện trên môi trường nhân giống với: hàm lượng đường 120g/l, NaCl 2‰, KH2PO4 1‰, nhiệt độ 280
C, hàm lượng (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 thay đổi từ 1 – 7 g/l, hàm lượng giống ban đầu là 3x106 tế bào/ml. Sau 24h nuôi cấy trên máy lắc, thu được kết quả như sau:
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ vô cơ tới quá trình nhân giống
(M.106±m tb/ml) Hàm lượng (g/l) 1 2 3 4 5 6 7 (NH4)2SO4 143±0,7 179±0,4 198±1,0 203±0,9 200±0,3 181±0,5 163±0,8 (NH4)2HPO4 134±0,3 185±0,6 196±0,6 176±1,0 164±0,7 159±0,7 132±0,56
Qua nghiên cứu thấy được rằng, hàm lượng (NH4)2SO4 phù hợp với sự sinh trưởng của chủng S.cerevisiae M2 là 3-5 g/l, hàm lượng (NH4)2HPO4 là 2-3g/l. Đối với 2 nguồn nitơ kể trên thì (NH4)2SO4 tốt cho sự sinh trưởng của chủng S.cerevisiae M2 hơn (NH4)2HPO4.
3.4. NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN
VANG TÁO MÈO CỦA CHỦNG S.cerevisiae M2
Để xác định động thái của quá trình lên men vang táo mèo, tôi tiến hành lên men trong các bình dung tích 500ml. Môi trường lên men là dịch siro táo mèo được pha loãng với nước cất để hàm lượng đường đạt 220g/l. Tiến hành khử trùng môi trường bằng K2S2O5 (chứa 55% SO2 ) với hàm lượng 50mg/l. Sau 6 tiếng bổ sung K2S2O5 vào môi trường thì tiến hành cấy giống với tỉ lệ 10%, pH = 4. Các bình cấy giống được chuyển vào tủ ấm 30oC. Tiến hành phân tích mẫu mỗi ngày một lần trong 10 ngày liên tục. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7 và đồ thị 3.3.
Bảng 3.7. Sự biến đổi hàm lƣợng đƣờng và cồn trong quá trình lên men vang táo mèo
Ngày 0 2 4 6 8 10 Hàm lượng đường (g/l) 220 190 120 100 80 70 Hàm lượng cồn (%V) 0 3 5 5,5 6 6,5
0 50 100 150 200 250 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ngày s ố lư ợ ng t ế bà o x t ri ệ u
Đồ thị 3.3. Động thái của quá trình lên men vang táo mèo
Kết quả cho thấy: tế bào nấm men sinh sản nhanh nhất vào ngày thứ 2 đến ngày thứ 5 và tiếp tục duy trì cho đến ngày thứ 6; 7 nhưng sau đó thì giảm dần và giảm nhanh đến ngày thứ 9, đến ngày thứ 10 số lượng tế bào nấm men giảm chỉ còn 123x106 tế bào/ml.
Ở ngày thứ 2 đến ngày thứ 5, số lượng tế bào đạt cực đại là do môi trưòng nhiều dinh dưỡng, hàm lượng cồn còn thấp chưa có khả năng ức chế sự sinh trưởng, phát triển của nấm men. Đến ngày thứ 9 và 10, hàm lượng cồn tăng mạnh, đặc biệt là nguồn dinh dưỡng cạn kiệt làm cho tế bào nấm men tự phân và lắng xuống đáy bình.
Hàm lượng đường giảm mạnh vào ngày thứ 5, độ cồn vì thế cũng tăng lên mạnh mẽ. Ngày thứ 9 độ cồn vẫn tăng nhưng tăng chậm, hàm lượng đường tổng số cũng giảm nhưng chậm chạp. Như vậy, sự biến đổi của hàm
lượng cồn và hàm lượng đường có quan hệ chặt chẽ với nhau theo sụ biến động của số lượng tế bào nấm men.
Hàm lượng axit tổng số cũng tăng dần nhưng không lớn lắm là do trong quá trình lên men rượu, ngoài việc tạo ra sản phẩm chính là rượu thì còn tạo nên các axit như xucxinic, axetic, lactic… Theo CH.Barthomenf (1986), thuỷ phân 100 phần đường saccaroza sẽ thu được 0,7 phần axit xucxinic. Sự tạo thành axit trong quá trình lên men đã làm giảm độ pH của dịch lên men.
3.5. NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN VANG TÁO MÈO QUÁ TRÌNH LÊN MEN VANG TÁO MÈO
Quá trình lên men vang táo mèo chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố như: nhiệt độ, pH, hàm lượng đường ban đầu, hàm lượng men giống. Trong phạm vi đề tài này tôi chỉ nghiên cứu ảnh huởng của hàm lượng đường, nhiệt độ và pH. Để đánh giá khả năng lên men, chúng tôi dựa vào các chỉ tiêu: lượng CO2 thoát ra, hàm lượng đường sót và hàm lượng cồn (độ rượu) tạo ra.
3.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường tới khả năng lên men vang táo mèo
Hàm lượng đường có trong dịch lên men không chỉ ảnh hưởng đến hoạt động sống của nấm men mà còn ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm. Vì đường tạo ra vị ngọt cùng với vị chua của axit ở tỉ lệ thích hợp sẽ làm tăng giá trị cảm quan và hương vị đặc trưng của vang.
Dịch lên men là dịch chiết táo mèo được pha với nước cất với tỉ lệ khác nhau để hàm lượng đường ban đầu đạt các mức độ 160g/l; 180g/l; 210g/l; 230g/l; 250g/l; 270g/l với pH = 4, hàm lượng men giống 10%, tiến hành lên men ở nhiệt độ 28-300C ở các bình có dung tích 100ml.
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng tới quá trình lên men vang táo mèo
Ngày Chỉ tiêu Hàm lượng đường ban đầu (g/l)
160 180 210 230 250 270 7 Lượng CO2 thoát ra ( g ) 0,85±0,1 0,64±0,1 1,63±0,1 1,45±0,1 0,61±0,1 0,52±0,1 Hàm lượng đường sót (g/l) 130±1,3 150±11,0 150±1,5 140±1,7 200±2,0 210±1,4 Hàm lượng cồn tạo ra (%V) 4.5±0,1 4.5±0,2 6.5±0,1 6±0,1 5±0,2 3.5±0,1 15 Lượng CO2 thoát ra (g ) 2,15±0,1 2,28±0,1 3,12±0,1 2,85±0,1 2,03±0,1 1,76±0,1 Hàm lượng đường sót (g/l) 100±1,8 110±1,6 80±1,5 85±1,5 110±1,0 120±1,1 Hàm lượng cồn tạo ra (%V) 5±0,3 6±0,2 7.5±0,1 7.5±0,1 6.5±0,1 5.5±0,2
Nhìn vào bảng trên ta thấy, cùng với sự tăng lượng CO2 thoát ra thì hàm lượng đường ban đầu trong môi trường giảm xuống. Sự giảm nồng độ đường là do nấm men đồng hoá đường để tăng trưởng và lên men. Với hàm lượng đường 210-230g/l thì nấm men phát triển tốt, lượng CO2 thoát ra lớn, lượng đường sót thấp, độ cồn cao thích hợp cho lên men vang bàn ăn. Đối với hàm
lượng đường trên 250g/l thì lượng CO2 tạo ra cũng nhiều nhưng lượng đường sót vẫn cao nên chỉ phù hợp cho lên men vang ngọt.
Khi hàm lượng đường trong dịch lên men cao đã làm cho áp suất thẩm thấu của dịch lên men tăng lên. Hơn nữa, hàm lượng cồn tạo ra trong quá trình lên men đã ức chế quá trình trao đổi chất và hoạt động sống của nấm men cũng như ức chế hoạt động của nhiều enzym làm hiệu suất lên men bị giảm.
Khi hàm lượng đường trong dịch lên men 160g/l – 180 g/l thì hàm lượng cồn thấp, rất khó bảo quản và ổn định chất lượng trong quá trình tàng trữ và tiêu thụ. Hàm lượng đường trong dịch lên men cao > 250 g/l thì hiệu suất lên men và khả năng tạo cồn lại thấp.
Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng đường là 220 g/l là phù hợp cho quá trình lên men vang táo mèo.
3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới khả năng lên men vang táo mèo
Trong quá trình lên men, pH luôn thay đổi dẫn đến khả năng sinh sản và phát triển của nấm men bị ảnh hưởng. Để nâng cao chất lượng của vang ,việc nghiên cứu tìm ra khoảng pH tối ưu cho quá trình lên men là hết sức cần thiết. Chúng tôi tiến hành sử dụng chủng nấm men S.cerevisiae M2 vào lên men ở các điều kiện pH khác nhau: pH = 3; pH = 3,5; pH = 4; pH =4,5; pH = 5 với hàm lượng đường 220g/l, hàm lượng men giống 10%, lên men ở nhiệt độ 28-300C trong các bình dung tích 100ml.
Kết quả thu được ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của pH tới quá trình lên men vang táo mèo
Ngày Chỉ tiêu pH ban đầu
pH = 3 pH = 3,5 pH = 4 pH = 4,5 pH = 5 Lượng CO2
thoát ra ( g )
7 Hàm lượng đường sót g/l 180±1,5 170±1,7 140±1,0 150±1,4 180±1,0 Hàm lượng cồn tạo ra(%V) 4±0,0 4.5±0,1 5.5±0,0 5±0,2 4±0,1 15 Lượng CO2 thoát ra ( g ) 2,0±0,0 2,33±0,0 2,87±0,1 3,1±0,0 2,5±0,1 Hàm lượng đường sót g/l 110±1,9 100±2,0 80±1,7 70±1,4 100±1,6 Hàm lượng cồn tạo ra(%V) 7±0,1 7±0,1 8±0,1 7.5±0,2 6.5±0,1
Qua bảng trên nhận thấy, pH = 4 - 4,5 thích hợp đối với quá trình lên men của chủng nấm men đã phân lập được. Hàm lượng đường trong dịch lên men đã giảm đi đáng kể, hiệu suất lên men cao. Khi môi trường có độ axit cao ( pH=3-3,5 ) ức chế tế bào nấm men phát triển, hàm lượng đường sót cao. Khi pH=5 và lớn hơn, nấm men cũng chậm phát triển, môi trường lên men thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây chua rượu vang.
Vậy pH ban đầu thích hợp nhất cho quá trình lên men rượu vang là pH = 4- 4,5. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của các tác giả khác [9], [10]
khi nghiên cứu quá trình lên men vang táo mèo.
3.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo.
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất đối với nấm men nói chung và lên men nói riêng. Nó có tác dụng rõ rệt đến khả năng lên men của chủng nấm men và chất lượng của vang (độ rượu, đường sót, chất thơm). Cho nên mỗi loại vang cần có một quy trình công nghệ riêng thích hợp, nhất là nhiệt độ lên men. Hơn nữa, nước ta là nước nhiệt đới gió mùa nóng ẩm. Do đó theo chúng tôi việc
nghiên cứu tìm ra khoảng nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là cần thiết để nâng cao chất lượng của vang.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men, chúng tôi sử dụng chủng nấm men S.cerevisiae M2 cho lên men ở nhiệt độ: 250C; 280C; 300C; 350C với hàm lượng đường 220g/l; hàm lượng men giống 10%; pH = 4. Lên men ở các bình dung tích 100ml.
Kết quả thu được ở bảng 3.10.
Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo
Ngày Chỉ tiêu Nhiệt độ (t0C) t0C = 250C t0C = 280C t0C = 300C t0C = 350C 7 Lượng CO2 thoát ra (g ) 1,12±0,1 1,81±0,0 1,63±0,1 0,83±0,0 Hàm lượng đường sót (g/l) 180±1,0 140±1,4 150±1,2 170±1,7 Hàm lượng cồn tạo ra (%V) 3,5±0.2 4,5±0.1 4,7±0,1 3,0±0,0 15 Lượng CO2 thoát ra ( g ) 2,16±0,0 3,5±0,0 3,2±0,2 1,75±0,1 Hàm lượng đường sót (g/l) 130±1,9 110±2,0 115±1,3 140±1,5 Hàm lượng cồn tạo ra (%V) 6±0.3 7±0,2 7.5±0,1 6±0,1
Qua kết quả thể hiện ở bảng trên nhận thấy nhiệt độ trong khoảng 280C - 300C thuận lợi nhất cho quá trình lên men, hàm lượng đường sót thấp. Đặc biệt là ở nhiệt độ 280C thì hiệu quả lên men cao nhất, hiệu suất chuyển hoá
đường tốt nhất, độ cồn cao. Khi nhiệt độ < 280
C hoặc > 300C đều ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của nấm men, vì vậy hiệu suât lên men giảm.
Vậy nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men vang táo mèo là 28-300
C. Các tác giả khác [9] ; [10] ; [11] cũng cho kết quả tương tự.
3.6. ỨNG DỤNG LÊN MEN VANG TÁO MÈO VỚI QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi tiến hành lên men vang táo mèo với chủng S.cerevisiae M2, được thực hiện ở nhiệt độ 280C, hàm lượng đường ban đầu 220g/l, hàm lượng men giống 10% với pH = 4. Tiến hành lên men trong bình dung tích 2lít, sau 15 ngày kết thúc giai đoạn lên men chính, đánh giá rượu bằng cảm quan sau đó chuyển tiếp sang lên men phụ.
Kết quả phân tích được dẫn ở bảng 3.11.