546 mẫu thực vật nổi được thu thậ p1 lần/tuần vào lúc 8-9 giờ sáng vào mùa khô năm 1998 đến năm 2003 Đồng thời các quan trắc về điều kiện môi trường trong
2.3.3. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
Từ các dữ liệu khảo sát trong ao nuôi tôm, chúng tôi thiết kế các thí nghiệm về ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ mặn, muối dinh dưỡng) hay hóa chất thường dùng trong nuôi tôm đến sự phát triển của thực vật nổi nói chung và các loài ưu thế nói riêng. Với các kết quả nghiên cứu này chúng ta có thể kiểm định, đánh giá được mức độ phát triển của các ngành TVN trong ao và có cơ sở cho việc điều chỉnh hợp lý quần xã TVN trong ao nuôi tôm.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, độ mặn và một số loại muối dinh dưỡng lên sự phát triển của 3 loài thực vật nổi ưu thế.
Với dữ liệu từ tài liệu tham khảo [13], [26], [27], [30], [45] và kết quả khảo sát thực vật nổi trong các ao nghiên cứu cho thấy có một số loài thuộc các chi tảo Silíc (Nitzschia, Navicula, Coscinodiscus), tảo Lam (Phormidium, Oscillatoria) và tảo Lục
Chlorella thường phát triển mạnh trong các ao nuôi tôm. Trong đó 3 loài
Phormidium sp1 (tảo Lam), Nitzschia longissima (tảo Silíc), Chlorella sp1 (tảo Lục) là những loài bắt gặp thường xuyên trong các ao nuôi tôm ở Khánh Hòa cũng như ở một số tỉnh Nam Trung Bộ (Quảng Nam, Ninh Thuận,…).
Kết hợp tài liệu tham khảo và kết quả khảo sát về các yếu tố lý, hóa học môi trường nước ao nuôi tôm, hàm lượng muối dinh dưỡng, nhiệt độ và độ mặn được chọn làm thí nghiệm (với mức nhỏ nhất, trung bình và lớn nhất) là:
- Muối dinh dưỡng: Nitrat (NO3- - N): 0,1, 0,3 và 0,6 mg/L; Phốt phát (PO43- - P): 0,025, 0,075 và 1mg/L; Silíc (SiO2): 0,2, 0,7 và 1,2 mg/L.
- Nhiệt độ: 25, 30 và 35oC. - Độ mặn: 15, 25 và 35 ‰.
Các thí nghiệm được thiết kế theo sơ đồ sau:
NO
3-N (mg/L) 0,1; 0,3; 0,6
Muối dinh dưỡng Nhiệt độ (0C) Độ mặn (‰)
PO
4-P(mg/L) SiO32--Si (mg/L)
0,025; 0,075; 0,1 0,2; 0,7; 1,2 25; 30; 35 15; 25; 35
Thu mẫu và đánh giá: số lượng tế bào của từng loài tảo theo thời gian Các lô thí nghiệm
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của một số loại muối dinh dưỡng, nhiệt độ và độ mặn lên sự phát triển của 3 loài thực vật nổi ưu thế.
Hình 2.2. Các loài Thực vật nổi ưu thế trong các ao nuôi Tôm Sú: a.- Nitzschia longissima; b.- Phormidium sp.; và c.- Chlorella sp.
Tảo giống được phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch (agar) hay phương pháp pha loãng.
+ Phương pháp pha loãng [114] (đối với Phormidium sp. và Nitzschia longissima): Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm có chứa 9 mL dung dịch nước nuôi tảo có môi trường chỉ định cho loài tảo định phân lập (môi trường cho tảo Lam [19] và tảo Silíc [27]). Dùng pipet hút 1mL dịch tảo tạp cho vào ống nghiệm thứ nhất. Sau khi tảo phát triển vài ngày, lấy 1mL cho vào ống nghiệm thứ 2. Cứ làm như vậy với các ống nghiệm còn lại, sao cho trong mỗi ống nghiệm chỉ có vài tế bào. Các ống nghiệm được đặt trong điều kiện thích hợp để cho tảo phát triển. Cuối cùng chọn những ống nghiệm có tế bào tảo định phân lập chiếm ưu thế, lặp lại việc cấy chuyền vài lần rồi nhân sinh khối lấy tảo giống.
Chuẩn bị môi trường thạch: Lấy 5 gam agar cho vào 500mL nước biển, bổ sung môi trường dinh dưỡng THO4 [29], autoclave ở nhiệt độ 121oC và 15at/15 phút. Sau đó để nguội đến 45 – 50oC, đổ thạch vào hộp lồng (10 mL/hộp), để nguội.
Phân lập: Nhỏ 1mL dung dịch tảo tạp lên bề mặt thạch, tráng đều cho dịch tảo dàn đều trên thạch. Đặt hộp lồng dưới hệ thống đèn neon (4200 lux), nhiệt độ 28 – 30oC. Sau một tuần, trên mặt thạch xuất hiện những khuẩn lạc có màu sắc và hình dạng khác nhau (tuỳ theo loài tảo). Dùng que cấy lấy các khuẩn lạc tươi đưa lên kính hiển vi quan sát, chọn khuẩn lạc có Chlorella (hình tròn, màu xanh sáng) chuyển sang các ống nghiệm (có môi trường dinh dưỡng) nuôi cấy để tảo phát triển. Sau vài ngày, lấy dịch tảo trong ống nghiệm đem phân lập lại như lúc đầu. Sau vài lần phân lập, sẽ thu được tảo thuần chủng, rồi đem nhân sinh khối.
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trung tâm công nghệ sinh học (Trường Đại học Thủy sản). Tảo được nuôi trong các bình nón (đậy nút bông đã khử trùng) có thể tích nuôi (V) = 1 lít, mỗi thí nghiệm được lặp lại từ 2 - 3 lần.
Hình 2.4a-b. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên sự phát triển của tảo.
Thí nghiệm 1: Thí nghiệm ảnh hưởng của các loại muối dinh dưỡng lên sự phát triển của 3 loài TVN ưu thế
Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm [5], trong thực nghiệm yếu tố toàn phần số thí nghiệm được tính theo công thức: N = nk ( N là số thí nghiệm; n là các mức của yếu tố thí nghiệm; k là các yếu tố thí nghiệm). Theo công thức trên, số lô thí nghiệm cần thực hiện cho mỗi loài như sau:
+ Đối với tảo Silíc Nitzschia longissima: Với 3 loại muối (nitrat, phốt phát,
silíc), mỗi loại có 3 hàm lượng khác nhau nên N = nk = 33 = 27 lô. Dựa và hàm lượng nitrat (loại muối dinh dưỡng đóng vai trò quan trong sự gia tăng tế bào của tảo) có thể chia thành 3 nhóm lô thí nghiệm với mật độ nuôi ban đầu là 104 tế bào/mL, nhiệt độ từ 28 đến 30oC và độ mặn là 30 ‰.
Nhóm 1: với hàm lượng NO3- - N = 0,1 mg/L. PO43- - P = 0,025; 0,075; 0,1 mg/L. SiO3 = 0,2; 0,7 và 1,2 mg/L (bảng 2.3).
Bảng 2.3: 9 lô thí nghiệm (lô 1 - lô 9) về ảnh hưởng của NO3—N, PO43—P và SiO3—
(mg/L) lên sự phát triển của Nitzschia longissima
1. N:P:Si = 0,1:0,025:0,2 2. N:P:Si = 0,1:0,025:0,7 3. N:P:Si = 0,1:0,025;1,2
4. N:P:Si = 0,1;0,075:0,2 5. N:P:Si = 0,1:0,075:0,7 6. N:P:Si = 0,1:0,075:1,2
7. N:P:Si = 0,1:0,1:0,2 8. N:P:Si = 0,1:0,1:0,7 9. N:P:Si = 0,1:0,1:1,2
Nhóm 2: với NO3- - N = 0,3 mg/L; PO43- - P = ,025; 0,05 và 0,1 mg/L; SiO3 = 0,2; 0,7 và 1,2 mg/L (bảng 2.4).
Bảng 2.4: 9 lô thí nghiệm (lô 10 - lô 18) về ảnh hưởng của NO3—N, PO43—P và SiO3—
(mg/L) lên sự phát triển của Nitzschia longissima.
10. N:P:Si = 0,3:0,025:0,2 11.N:P:Si = 0,3:0,025:0,7 12. N:P:Si = 0,3:0,025;1,2
16. N:P:Si = 0,3:0,1:0,2 17. N:P:Si = 0,3:0,1:0,7 18. N:P:Si = 0,3:0,1:1,2
Nhóm 3: với NO3- - N = 0,6 mg/L. PO43- - P = ,025; 0,05 và 0,1 mg/L. SiO3 = 0,2; 0,7 và 1,2 mg/L (bảng 2.5)
Bảng 2.5: 9 lô thí nghiệm (lô 19 - lô 27) về ảnh hưởng của NO3—N, PO43—P và SiO3—
(mg/L) lên sự phát triển của Nitzschia longissima.
19. N:P:Si = 0,6:0,025:0,2 20.N:P:Si = 0,6:0,025:0,7 21. N:P:Si = 0,6:0,025;1,2
22. N:P:Si = 0,6:0,075:0,2 23.N:P:Si = 0,6:0,075:0,7 24. N:P:Si = 0,6:0,075:1,2
25. N:P:Si = 0,6:0,1:0,2 26. N:P:Si = 0,6:0,1:0,7 27. N:P:Si = 0,6:0,1:1,2
+ Đối với tảo Lam Phormidium sp.1 và tảo Lục Chlorella sp.1: Với 2 loại muối dinh dưỡng (nitrat, phốt phát) và mỗi loại có 3 hàm lượng khác nhau, do đó N = nk = 32 = 9 lô cho mỗi loài và cũng chia làm 3 nhóm lô thí nghiệm (bảng 2.6). Mật độ nuôi ban đầu là 104 tế bào/mL đối với Phormidium và 106 tế bào/mL đối với
Chlorella. Cả 2 loài tảo này được nuôi ở nhiệt độ và độ mặn tương ứng là 28 đến 30oC và 30 ‰.
Bảng 2.6. 9 lô thí nghiệm (nhóm I, II, III) về ảnh hưởng của NO3—N, PO43—P (mg/L) lên sự phát triển của Phormidium sp.1 và Chlorella sp.1.
Nhóm I: 1. N:P = 0,1:0,025 2. N:P = 0,1:0,075 3. N:P = 0,1:0,1 Nhóm II: 4. N:P = 0,3:0,025 5. N:P = 0,3:0,075 6. N:P = 0,3:0,1 Nhóm III: 7. N:P = 0,6:0,025 8. N:P = 0,6:0,075 9. N:P = 0,6:0,1
Thí nghiệm 2: Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên sự phát triển của 3 loài TVN ưu thế
Số lô thí nghiệm: Với 2 yếu tố thí nghiệm, mỗi yếu tố có 3 mức khác nhau, số lô thí nghiệm cần thực hiện N = Nk = 32 = 9 cho mỗi loài (bảng 2.7). Môi trường dinh
dưỡng cho tảo Silic- Nitzschia longissima là N : P : Si = 0,6 : 0,1 : 1,2 (mg/L);
Phorrmidium sp1 và Chlorella là: N : P = 0,6 : 0,1 (mg/L). Mật độ nuôi ban đầu là 104 tế bào/mL đối với Phormidium sp.1, Nitzschia lnogissima và 106 tế bào/mL đối với Chlorella sp.1
Bảng 2.7: 9 lô thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên sự phát triển của
Phormidium sp.1, Chlorella sp.1và Nitzschia longissima.
Lô 1: 15‰: 250C Lô 2: 15‰: 300C Lô 3: 15‰: 350C
Lô 4: 25‰: 250C Lô 5: 25‰: 300C Lô 6: 25‰: 350C
Lô 7: 35‰: 250C Lô 8: 35‰: 300C Lô 9: 35‰: 350C
Các bình thí nghiệm được đặt trong các bo can để ổn định nhiệt độ (hình 2.4b) và sử dụng hệ thống Thesmotat hay máy nâng nhiệt Visi - Therm để điều chỉnh nhiệt độ (biên độ dao động của nhiệt độ trong từng lô thí nghiệm là ± 0, 50C). Độ mặn được kiểm tra bằng khúc xạ kế, độ chính xác 1‰.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của Formaline, Chlorine và Benzal Konium Chlorua lên sự phát triển của quần xã thực vật nổi.
Dựa vào các tài liệu tham khảo trong nước và một số nước khác (Thái lan, Trung Quốc) [6] [84] [87] [90] [95] cùng với sự điều tra về việc sử dụng các loại hóa chất trong nuôi tôm thương phẩm ở một số vùng nuôi tôm thuộc Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Định cho thấy có rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để cải tạo ao, xử lý nước hoặc để hạn chế sự phát triển của sinh vật nổi.
Trong các loại hóa chất, một số loại thường được sử dụng để xử lý nước, tẩy trùng đáy ao, hạn chế sự phát triển của thực vật nổi, động vật nổi là Chlorine với hàm lượng 5 - 30 ppm (diệt vi tảo: 5 - 10 ppm), Formaline với hàm lượng 0,3 - 25 ppm
(dùng diệt vi tảo là 3 - 15ppm) và Benzal Konium Chlorua (BKC) với hàm lượng 0,3 - 1,0 ppm. Tuy nhiên do chưa nắm vững cơ sở khoa học cũng như vai trò chủ yếu của
các loại hóa chất trên đối với sự phát triển của tảo hay các thủy sinh vật khác nên việc sử dụng hóa chất không hiệu quả.
Để giải quyết vấn đề trên, chúng tôi thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng của Chlorine, Formaline và BKC lên sự phát triển của tảo.
Hàm lượng hóa chất được chọn làm thí nghiệm là: + 5, 10, 15 và 20 ppm đối với Formaline
+ 5, 10 và 15 ppm đối với Chlorine
+ 0,5 và 1,0 ppm đối với BKC (Benzal Konium Chlorua hay còn gọi Clean 80)
Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:
5,0; 10; 15; 20 BKC (Benzal Konium
Chlorua) (ppm) Formaline (ppm) Chlorine (ppm) Đối chứng (không hóa chất)
0,5; 1,0 5,0; 10; 15
Thu mẫu tảo theo thời gian nuôi và phân tích các thông số:
Thành phần loài và mật độ tế bào Các yếu tố: ToC; S‰; pH Bể (m3): Nguồn tảo giống ban đầu + muối dinh dưỡng
khi nước bắt đầu đậm màu ( pH = 8,7 - 9,0)
Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm về sự phát triển của thực vật nổi khi xử lý Chlorine, Formaline và BKC.
Thí nghiệm được tiến hành trong các xô nhựa (V = 70 - 80 lít). Các xô này được đặt trực tiếp trong ao nuôi tôm (Trung tâm NTTS Cửa Bé - Nha Trang) bằng giàn đỡ. Bắt đầu xử lý hóa chất (vào 9 - 10 giờ sáng và 3- 4 giờ chiều). Sau 12 giờ xử lý hoá chất, bổ sung muối dinh dưỡng vào các lô thí nghiệm (trừ đối chứng) để cho tảo phát triển trở lại.
Sau khi xử lý hóa chất, thu mẫu tảo để kiểm tra mức độ ảnh hưởng của hóa chất đến sự phát triển của tảo (6 giờ thu mẫu tảo một lần). Mẫu tảo được thu bằng cách dùng lọ (V = 150mL) lấy tảo ở 3 tầng nước trong xô rồi chuyển sang bình thủy tinh có V = 500 mL, đánh dấu mẫu và bảo quản mẫu bằng lugol 1%.
2.6a
2.6b
Hình 2.6a và b. Thí nghiệm ảnh hưởng của hóa chất lên sự phát triển của thực vật nổi.
Hình 2.7. Bể thử nghiệm điều chỉnh sự phát triển của thực vật nổi qui mô 1 m3.
- Thử nghiệm quản lý mật độ tế bào của thực vật nổi
Sử dụng bể composite có thể tích 1 m3 (hình 2.7) và lấy nước (từ ao nuôi tôm) cho vào bể. Xác định mật độ tảo, giá trị pH ban đầu và bổ sung muối dinh dưỡng (hàm lượng N03-N : PO43—P : SiO3-S = 0,6 : 0,1 : 1,2 mg/L mà tảo phát triển tốt nhất ở thí nghiệm 1). Hàng ngày theo dõi sự phát triển của tảo (khoảng 6 giờ thu mẫu tảo một lần) và giá trị pH môi trường. Khi pH = 9,5 - 10, tiến hành xử lý 5ppm Formaline hoặc thay nước (30% lượng nước trong bể). Sau 24 giờ bổ sung muối dinh dưỡng, tiếp tục theo dõi sự phát triển của tảo và các yếu tố môi trường.
Các ao nuôi tôm ở Đồng Bò - Nha Trang và ao nuôi tôm tại Trung tâm NTTS Cửa Bé - Nha Trang (mùa khô: tháng 5 - 8 /2002) được đưa vào thực nghiệm (bảng 2.8a và b).
Bảng 2.8a: Qui trình thí nghiệm nuôi tôm công nghiệp với việc điều chỉnh mật độ thực vật nổi tại Đồng Bò - Nha Trang.
-1,5 - 0,5 Thả
giống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Thời gian (tuần) Bón vôi (CaO):
1000 kg/ha. Diệt khuẩn đáy ao: Chlorine (20ppm). Lấy nước từ ao cấp đến mức 1,2 m Gây màu nước: NPK (3ppm) và SiO32- (1ppm). Mật độ 35 con/ m2 Bổ sung nước từ ao cấp đến mức 1,2 m
Thay nước 10 - 20%/ tuần Bổ sung và thay nước 6 - 14 giờ / ngày đêm Quạt nước
(1 - 2) lần/ 4 tuần Xử lý Formaline: 10 -15ppm
Sau khi xử lý hóa chất 3
ngày Sử dụng EM2 10ppm
1 tuần / lần Bón CaO 200 kg/ha.
CaMgO2 2ppm.
Bảng 2.8b: Qui trình thí nghiệm nuôi tôm thương phẩm với việc điều chỉnh mật độ thực vật nổi tại Cửa Bé - Nha Trang.
-1,5 - 0,5 Thả
giống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Thời gian (tuần) Bón vôi (CaO): 1000 kg/ha. Diệt khuẩn đáy ao: Chlorine (20ppm). Lấy nước từ ao cấp đến mức 1,0 m Gây màu nước bằng NPK 3 ppm và silíc 1 ppm Mật độ: 40 con/ m2
Bổ sung nước hao hụt từ ao cấp đến mức 1m
Bổ sung và thay nước 6 - 14 giờ / 24 giờ Quạt khí
2 tuần / lần Xử lý nước bằng chlorine, Formaline (10ppm) và Mazzal 0,3ppm
2 tuần/lần Giảm pH bằng đường (2 - 5ppm) và A. citric 1 tuần / lần, sau khi xử lý hóa chất ít nhất 3 ngày Xử lý nước ô nhiễm bằng EM2 10 ppm. Trước khi thả giống
Thời gian nuôi tôm Thu hoạch: ngày nuôi
thứ 82