3. Ý nghĩa của đề tài
2.3.4.Phương pháp PCR-ISSR
Phương pháp PCR với các mồi ISSR được thực hiện trên máy PCR PTC - 100 (MJ Research Inc, Mỹ), với tổng thể t ch là 25 l/mẫu gồm những thành phần được nêu ở bảng 2.6. Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR-ISSR STT Thành phần Thể t ch (µl) 1 H2O 13,8 µl 2 dNTP (2,5 mM) 2,5 µl 3 Đệm 10× PCR 2,5 µl 4 MgCl2 (25 mM) 2 µl
26
5 Mồi ISSR (10 ng/μl) 2 µl
6 Enzyme Taq Sigma polymerase (5 UI/μl) 0,2 µl
7 DNA tổng số (25 ng/µl) 3 µl
Tổng thể t ch (µl) 25 µl
Trộn đều các thành phần của hỗn hợp rồi chuyển vào máy PCR sau đó chạy theo chương trình đã cài đặt sẵn với 40 chu kỳ như sau:
Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng PCR-ISSR
2.3.5. Phương pháp phân tích số liệu
Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu và tính toán theo DNA thang chuẩn (DNA marker). Nếu một băng DNA (có k ch thước cụ thể) xuất hiện ở mẫu A nhưng không xuất hiện ở mẫu B hoặc đồng thời xuất hiện ở cả A và nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác thì băng DNA này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng DNA này xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình.
Các băng được mã hóa bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu mẫu nào có băng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số liệu này được nhập trực tiếp vào Excel và sau đó được xử lý theo chương trình NTSYS 2.1 để tính ma trận tương đồng giữa các cặp mẫu [26]. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng hệ số tương đồng di truyền Jaccard và phương pháp t nh UPGMA trong chương trình NTSYS 2.1 để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu Ba kích.
40 chu kỳ 94oC 94oC 5 phút 30 giây 50oC 50 giây 1 phút 10 phút 72 oC 72 oC 15oC ∞
27
Hệ số tương đồng di truyền được tính theo công thức của Nei và Li (1979). Theo Nei và Li thì công thức tính hệ số tương đồng di truyền là:
S= B A AB N N N . 2
Trong đó: S là hệ số tương đồng di truyền NAB là số băng DNA có ở cả mẫu A và NA là số băng DNA có ở mẫu A
NB là số băng DNA có ở mẫu
Ngoài ra, để đánh giá hiệu quả sử dụng mồi thì các nhà khoa học còn đưa ra một thông số nữa, đó là hàm lượng thông tin t nh đa hình (PIC - Polymorphic Information Content) hay hệ số đa hình di truyền cho mỗi locus (i) được tính theo công thức [37]. Hệ số PIC là thước đo của sự đa dạng alen ở từng locus. Hệ số này có thể được tính bằng phần mềm PIC calculator. Hệ số PIC được xác định dựa vào tần suất xuất hiên các bằng DNA hay các alen trên mỗi locus ISSR. Giá trị PIC cao tương ứng với locus đó có những alen và số alen xuất hiện cao. Tổng số các băng DNA có cùng k ch thước (được coi là cùng một allen) sẽ được nhập vào phần mềm này và sẽ đưa ra được hệ số PIC.
PIC (i) = 1 – Σ Pij 2
28
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA
Sau khi thực hiện tách chiết DNA, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của DNA trên máy đo quang phổ. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Bảng giá trị độ tinh sạch và nồng độ DNA của các mẫu Ba kích
Stt Tên mẫu OD260/280 Hàm lượng DNA ng/μl Stt Tên mẫu OD260/280 Hàm lượng DNA ng/μl 1 Bk1 1,83 304,8 21 Bk21 1,85 456,7 2 Bk2 1,85 507,4 22 Bk22 1,91 487,3 3 Bk3 1,84 166,2 23 Bk23 1,85 584,6 4 Bk4 1,79 335,6 24 Bk24 1,87 387,4 5 Bk5 1,80 157,3 25 Bk25 1,90 200,1 6 Bk6 1,88 368,1 26 Bk26 1,99 401,2 7 Bk7 1,95 372,4 27 Bk27 1,84 305,4 8 Bk8 1,82 270,3 28 Bk28 1,95 378,4 9 Bk9 1,90 414,0 29 Bk29 1,93 452,8 10 Bk10 1,87 458,8 30 Bk30 1,86 515,7 11 Bk11 1,80 613,9 31 Bk31 2,20 344,8 12 Bk12 1,82 566,4 32 Bk32 1,86 365,9 13 Bk13 1,88 431,1 33 Bk33 1,87 356,7 14 Bk14 1,87 501,2 34 Bk34 2,10 407,4 15 Bk15 1,97 302,4 35 Bk35 1,98 286,2 16 Bk16 1,85 478,4 36 Bk36 1,86 345,6 17 Bk17 1.93 552,8 37 Bk37 2,16 467,3 18 Bk18 1,86 245,7 38 Bk38 1,99 358,1 19 Bk19 1,99 234,8 39 Bk39 1,86 412,4 20 Bk20 1,81 376,9
29
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy các mẫu DNA có giá trị OD260nm/280nm biến thiên từ 1,79 – 2,2. Trong 39 mẫu chỉ có 4 mẫu không nằm trong khoảng giới hạn cho phép độ tinh sạch DNA OD260nm/280nm~1,8-2,0. Kết quả này phù hợp với yêu cầu của sản phẩm tách chiết DNA để phục cho các bước tiếp theo của thí nghiệm.
Ngoài ra chúng tôi còn kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số 18 mẫu Ba kích
Từ hình 3.1 cho thấycác băng DNA tổng số của 18 mẫu a k ch thu được đều sáng, băng gọn cũng như không xuất hiện vệt sáng kéo dài ở ph a dưới. Điều đó cho thấy DNA tổng số của các mẫu Ba kích sau khi tách chiết có độ nguyên vẹn và tinh sạch cao (các mẫu còn lại cũng cho kết quả tương tự)
3.2. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền Ba kích tím Quảng Ninh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để nghiên cứu quan hệ di truyền Ba kích, chúng tôi đã sử dụng các mồi ISSR có tên và trình tự tại bảng 2.2.
DNA tinh sạch được pha loãng để làm khuôn cho phản ứng ISSR. Sau khi hoàn thành phản ứng PCR, sản phẩm được điện di trên gel agarose 1,5% để phân t ch đa hình DNA của các mẫu nghiên cứu. Từ hình ảnh điện di, chúng tôi tiến hành phân tích dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của các băng DNA có k ch thước giống nhau ở các mẫu nghiên cứu. Ở hình ảnh đó, nếu có băng DNA hiện ở 1 giếng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Dựa
30
vào mức độ đa hình của các băng này chúng ta có thể đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu Ba kích. Trong quá trình nghiên cứu thì đã sử dụng 10 mồi ISSR, nhưng chỉ có 6 mồi cho sản phẩm đa hình.Sau đó, 6 mồi ISSR này được sử dụng để đánh giá đa dạng 39 mẫu Ba kích.
Sau đây là hai kết quả trong một số kết quả thu được của việc sử dụng chỉ thị ISSR trong phản ứng PCR. Hình ảnh điện di và đa hình các băng DNA thu được của sản phẩm PCR-ISSR khi sử dụng mồi ISSR 50, ISSR 56.
31
(A)
(B)
(C)
32
(A)
(B)
(C)
Hình 3.3 A, B, C: Ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR với mồi ISSR56
Dựa trên kết quả điện di thu được, tiến hành lập bảng thống kê kết quả với từng mồi nghiên cứu, với 2 chỉ số 0 (không có sự xuất hiện của băng vạch
33
quan tâm), 1 (có sự xuất hiện của băng vạch quan tâm). Bảng 3.2 là kết quả thống kê của mồi ISSR 56 với 39 mẫu Ba kích nghiên cứu.Các mồi còn lại cũng được tiến hành tương tự.
Bảng 3.2: Sản phẩm đa hình ISSR của mồi ISSR 56 nhận đƣợc sau khi chạy PCR với DNA tổng số của các mẫu Ba kích
Tên mẫu K ch thước(bp) 450 600 650 750 1000 1200 1400 1700 2000 Bk1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Bk2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Bk3 0 0 1 0 0 1 0 0 0 Bk4 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Bk5 0 0 1 0 0 1 0 0 0 Bk6 0 0 0 0 0 1 0 1 0 Bk7 0 0 1 1 0 0 0 0 0 Bk8 1 1 0 0 0 0 0 0 0 Bk9 0 1 0 1 0 0 0 0 0 Bk10 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Bk11 0 0 1 1 0 0 0 0 0 Bk12 1 0 1 0 0 0 0 0 0 Bk13 1 1 0 0 0 0 0 0 0 Bk14 0 0 0 1 0 0 1 1 0 Bk15 0 1 1 1 0 0 1 1 1 Bk16 0 0 0 1 0 0 1 1 1 Bk17 0 1 1 1 0 0 0 0 0 Bk18 0 1 1 0 0 0 0 0 0 Bk19 0 0 0 0 0 1 1 1 1 Bk20 0 0 1 0 0 1 1 1 1
34 Bk21 0 0 1 0 0 1 1 1 1 Bk22 0 0 1 1 1 1 1 1 0 Bk23 0 0 0 0 0 0 1 1 0 Bk24 0 1 1 1 1 1 1 1 1 Bk25 0 1 1 1 1 0 0 1 1 Bk26 0 0 0 0 0 1 0 0 1 Bk27 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Bk28 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Bk29 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Bk30 0 0 1 0 0 0 1 1 0 Bk31 0 0 1 0 1 0 0 1 0 Bk32 0 0 1 1 1 1 0 1 0 Bk33 0 1 1 0 1 0 0 0 0 Bk34 0 0 1 0 0 0 0 1 1 Bk35 0 0 1 0 0 1 1 1 1 Bk36 0 0 0 0 0 1 1 1 1 Bk37 0 0 1 0 0 0 1 1 1 Bk38 0 0 1 0 0 0 1 1 0 Bk39 0 0 1 0 0 1 1 1 1
Từ bảng 3.2 ta thấy các băng vạch phân bố từ 450 bp đến 2000 bp, trong đó có 119 băng xuất hiện thì có 119 băng đa hình. Số lượng băng đa hình xuất hiện là 100%. Nên mồi ISSR 56 có giá trị cao trong việc đánh giá đa dạng di truyền Ba kích.
Phân tích tổng hợp các băng DNA thu được trên hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR của các mồi và sử dụng phần mềm PIC calculator ta có thể
35
Bảng 3.3: Giá trị PIC và t lệ b ng đa hình của 3 mẫu Ba kích với 6 mồi ISSR.
STT Tên mồi PIC Số băng quan sát được Số băng đa hình T lệ băng đa hình(%) 1 ISSR46 0,7619 67 67 100 2 ISSR50 0,7422 118 118 100 3 ISSR51 0,7521 101 62 61 4 ISSR52 0,7553 74 74 100 5 ISSR53 0,8051 94 94 100 6 ISSR56 0,8628 119 119 100 Tổng 573 534 Trung bình 0,7799 93,5
Qua bảng 3.3 nhận thấy giá trị PIC của các mồi ISSR biến động trong khoảng 0,7422 đến 0,8628. Giá trị PIC trung bình là 0,7799. Các chỉ thị ISSR đều có giá trị PIC lớn hơn 0,5 chứng tỏ các mồi ISSR đã sử dụng có giá trị cao trong việc đánh giá mối quan hệ di truyền Ba kích. Mồi ISSR 50 cho giá trị PIC nhỏ nhất là 0,7422. Mồi ISSR 56 cho giá trị PIC lớn nhất là 0,8628. Chứng tỏ mồi ISSR 56 có khả năng rất cao trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền Ba kích.
Các băng DNA được nhân lên gồm có hai loại: Loại đơn hình (monomorphic) là loại băng DNA có cùng một k ch thước, có ở tất cả các giống nghiên cứu và loại đa hình (polymorphic) không có mặt ở mẫu này nhưng lại có mặt ở mẫu khác. Trong tổng số 573 băng thu được thì có 39 băng đơn hình xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu (chiếm 6,8%) và 534 băng đa hình (chiếm 93,2%). Mồi ISSR 56 nhân lên được số băng nhiều nhất (119 băng). Mồi ISSR 46 nhân lên được số băng t nhất (67 băng). Có 5 mồi cho t lệ đa hình là 100% (mồi ISSR 46, ISSR 50, ISSR 52, ISSR 53, ISSR
36
56) và mồi còn lại cho t lệ đa hình cao (lớn hơn 50%). Khi sử dụng mồi ISSR, nhận thấy số băng đa hình trung bình trên một mồi là khoảng 89 băng. T lệ đa hình cao cho thấy các mồi ISSR sử dụng có ý nghĩa cao trong phân tích, nghiên cứu đa dạng di truyền Ba kích.
Số liệu thu được từ kết quả PCR–ISSR được đưa vào xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 để tính hệ số tương đồng di truyền và xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu a k ch. Sau đó dựa vào hệ số tương đồng di truyền chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại được thể hiện trên hình 3.4. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
37
38
39
Quan sát bảng hệ số tương đồng (Bảng 3.4) nhận thấy hệ số tương đồng các mẫu nghiên cứu dao động trong khoảng 0,14 đến 0,88. Cặp giống có hệ số tương đồng thấp nhất là Bk17 và Bk6, cặp giống có hệ số tương đồng cao nhất là Bk14 và Bk16. Dựa trên biểu đồ hình cây (Hình 3.4) và chúng tôi chia 39 mẫu nghiên cứu làm 2 nhóm chính.
- Nhóm 1: gồm 16 mẫu Ba kích: Bk1, Bk11, Bk2, Bk12, Bk3, Bk5, k6, k10, k4, k8, k9, k13, k17, k18, k28, k7. Được chia làm 2 phân nhóm. + Phân nhóm 1: gồm 12 mẫu Ba kích: Bk1, Bk11, Bk2, Bk12, Bk3, Bk5, Bk6, Bk10, Bk4, Bk8, Bk9, Bk13. + Phân nhóm 2: gồm 4 mẫu Ba kích: Bk7, Bk18, Bk28, Bk17. - Nhóm 2: gồm 23 mẫu Ba kích: Bk14, Bk15, Bk16, Bk36, Bk37, Bk19, Bk20, Bk21, Bk22, Bk23, Bk26, Bk24, Bk25, Bk32, Bk30, k35, k29, k34, k38, k39, k27, k31, k33.Được chia làm 3 phân nhóm + Phân nhóm 1: gồm 20 mẫu Ba kích: Bk14, Bk15, Bk16, Bk36, Bk37, Bk19, Bk20, Bk21, Bk22, Bk23, Bk26, Bk24, Bk25, Bk32, Bk30, Bk35, Bk29, Bk34, Bk38,Bk39. + Phân nhóm 2: gồm 3 mẫu Ba kích: Bk27, Bk31, Bk33.
Từ kết quả trên có thể khẳng định có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích tím ở mức độ phân tử (kết luận này cũng được khẳng định ở nghiên cứu phân t ch đa dạng di truyền Ba kích bằng chỉ thị RAPD của Ding và cs (2006)). Trên cây phân loại 3 mẫu Ba kích tím có nguồn gốc từ Phú Thọ thuộc cùng một nhánh phân loại mức độ tương đồng từ 0,68 đến 0,88. Điều này khẳng định một điều ngoài mức độ đa dạng của những cá thể ở cùng một vùng địa lí còn có sự đa dạng giữa các cá thể thuộc các vùng địa lí khác nhau. Đây ch nh là một thuận lợi cho công tác chọn tạo giống, nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen Ba kích.
40
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
- Đã thu thập được 39 mẫu Ba kích tự nhiện và tách chiết DNA từ các mẫu Ba kích thu thập. DNA a k ch được tách chiết có chất lượng tốt và độ tinh sạch cao.
- Đã sàng lọc 10 mồi ISSR và chọn được 6 mồi ISSR để tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền Ba kích.
- Khi phân t ch đa dạng di truyền Ba kích bằng phương pháp PCR- ISSR thì thấy t lệ băng đa hình là 93,2%, giá trị PIC trung bình là 0,7799, điều này chứng tỏ 6 mồi ISSR đang sử dụng có ý nghĩa cao trong phân t ch, nghiên cứu đa dạng di truyền Ba kích.
- Thông qua số liệu phân t ch thu được khi sử dụng chỉ thị ISSR thì các mẫu a k ch được nghiên cứu chia thành 2 nhóm. Hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng 0,32 đến 0,88.
Từ kết quả có thể khẳng định có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích tím ở mức độ phân tử.
4.2. Kiến nghị
Do thời gian có hạn và khó khăn khi thu thập mẫu trong rừng tự nhiên nên chúng tôi chỉ phân t ch đa dạng đi truyền Ba kích tím Quảng Ninh bằng chỉ thị ISSR với 39 mẫu Ba kích và 6 mồi ISSR. Vì vậy chúng tôi có kiến nghị:
- Cần phân t ch đa dạng đi truyền Ba kích với số lượng mồi ISSR và số lượng mẫu ở mỗi quần thể nhiều hơn để thu được kết quả có độ ch nh xác cao hơn.
- Thử nghiệm phân t ch đa dạng đi truyền Ba kích trên nhiều chỉ thị khác nhau để có sự so sánh giữa các chỉ thị, chỉ thị nào cho độ ch nh xác hơn trong phân t ch đa dạng di truyền Ba kích thì sử dụng để nghiên cứu.
41
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1.Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y Học.
2.Đỗ Huy Bích (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục.
4. Trịnh Đình Đạt (2010), Công nghệ sinh học- Tập 4- Công nghệ di truyền, Nxb Giáo dục.
5. Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Hoàng Đăng Hiếu, Vũ Huyền Trang (2014), “Đánh giá đa dạng quần thể dó bầu (Aquilaria crassna
Pierre) tại Việt Nam bằng chỉ thị phân tử ISSR”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 4(30): 58-65.
6. Nguyễn Thị Thu Hương (2008), “ Nghiên cứu đặc t nh sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ dịch chiết rễ a k ch”, Luận văn thạc sĩ sinh học,Đại học Sư phạm Hà Nội 2.