3. Ý nghĩa của đề tài
2.3.3.Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Nguyên lý
Các phân tử axit nucleic t ch điện âm, do đó khi đặt chúng trong điện trường ổn định với hiệu điện thế thích hợp thì chúng di chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào điện tích, k ch thước, cấu trúc không gian của phân tử và nồng độ cấu thành gel.
Việc chọn nồng độ gel tùy thuộc vào k ch thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tách. Đoạn DNA có k ch thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng agarose trong gel càng lớn và ngược lại.
Trong điện di trên gel agarose, các đoạn DNA được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ Ethidium bromide (EtBr) có khả năng gắn xen giữa các base của DNA và phát huỳnh quang dưới tác dụng của UV. Sau khi điện di, gel được nhuộm với Ethidium bromide và soi bằng UV, các đoạn DNA hiện thành vạch sáng màu trên bản gel. Để ước lượng k ch thước các trình tự DNA trong gel agarose, người ta dùng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker - MWM), đó là một tập hợp các trình tự DNA có k ch thước đã biết (thang DNA - Marker) [3].
25
Các bƣớc thực hiện:
Chuẩn bị khay đổ gel và lược tạo các giếng điện di.
Chuẩn bị gel agarose 0,8%: cân 0,8g agarose sau đó bổ sung 100ml TAE 1X. Đun agarose trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành dung dịch đồng nhất.
Để dung dịch nguội khoảng 50-60o
C.
Đổ dung dịch vào khay sao cho không có bọt khí.
Sau 1h rút lược và đưa gel vào bể chạy điện di. Cho đệm TAE 1X ngập gel 2 mm.
Cho 5 µl loading dye vào mẫu, tra vào giếng, tra thang chuẩn DNA 1kb ở giếng cuối cùng và điện di ở hiệu điện thế 90V, thời gian chạy điện di từ 2h-2h30phút.
Sau khi điện di xong sẽ tiến hành nhuộm bản gel. Bản gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm trong 20-30 phút trong dung dịch EtBr 0,5µg/ml, rửa lại bằng nước cất và quan sát dưới tia UV (254 nm) trên máy soi DNA (Mini- transllumminatior, ioRad, Mỹ), ảnh được chụp bằng máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia iotech, Thụy Điển).