3. Ý nghĩa của đề tài
2.3.1.Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết và tinh sạch DNA các mẫu Ba k ch theo phương pháp CTAB của Doyle và cs có cải tiến.
a. Pha hóa chất
i) Đệm rửa
Bảng 2.4: Hóa chất pha đệm rửa
STT Hoá chất Nồng độ stock Nồng độ sử dụng Thể tích
1 Tris-HCl pH 8 1 M 100 mM 5 ml
22
3 Sorbitol Bột 0,35 M 3,1885 g
4 Na2HPO4 Bột 0,4% 0,5 g
Thêm nước đến thể tích cuối cùng 50 ml 50 ml
Để ở 4oC cho đến khi sử dụng và nên sử dụng trong 1 tháng. ii) Đệm tách chiết
Bảng 2.5: Hóa chất pha đệm chiết
STT Hoá chất Nồng độ stock Nồng độ sử dụng Thể tích 1 CTAB Bột 6% 1,5 g 2 NaCl 5 M 1,4 M 7 ml 3 EDTA pH 8 0,5 M 20 mM 2 ml 4 Tris-HCl pH 8 1 M 100 mM 2,5 ml 5 -Mercapto Ethanol 0,1% 25 l
Thêm nước đến thể tích cuối cùng 25 ml 25 ml Trước khi sử dụng để trong bể 65oC cho đệm chiết tan hoàn toàn, lấy thể tích cần dùng, cho thêm -Mercapto Ethanol 0,1% sau đó để lại bể 65oC đến khi sử dụng.
b) Các bƣớc tách chiết DNA:
Ngiền nhanh 0,2 g lá bằng cối chầy sứ trong nitơ lỏng cho đến khi tạo thành bột thật mịn, sau đó chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml, giữ trong đá.
Bổ sung 1ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây, ly tâm (12000 vòng/phút, 4oC, 7 phút).
23
Bổ sung 800 l đệm chiết, lắc đều và giữ ở 65o
C trong thời gian 30 phút đến 1 tiếng (cứ 15 phút đảo đều 1 lần).
Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.
Bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10 phút.
Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC (tuỳ từng loại mẫu, làm sao cho phần cặn lắng xuống).
Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml.
Bổ sung một thể t ch tương đương Isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 30 phút.
Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC.
Loại dich nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 l cồn 80%, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 4oC (bước này thực hiện 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol (tránh để các cuộn DNA rơi ra ngoài)
Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không..
Hoà tan trong 100 l H2O khử ion.
Sau khi DNA được hoà tan hoàn toàn thì bổ sung 3 l RNase (10mg/ml). Giữ sản phẩm ở 37oC trong thời gian 1 giờ.
Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});