2.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện: Từ tháng 9 năm 2012 đến tháng 12 năm 2013.
Địa điểm: Thí ngiệm được thực hiện tại nhà lưới và phòng thí nghiệm Chọn giống và ứng dụng công nghệ sinh học, Bộ môn Di truyền giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng trường Đại Học Cần Thơ.
2.1.2 Vật liệu nghiên cứu
Sử dụng dòng lúa CTUS4 (có nguồn gốc từ lúa sỏi mùa đột biến) do Phòng thí nghiệm Chọn giống và Ứng dụng Công nghệ sinh học, Bộ môn Di truyền giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng trường Đại Học Cần Thơ cung cấp.
2.1.3 Thiết bị và hóa chất
Thiết bị thí nghiệm: Máy đo độ mặn, máy ly tâm, máy vortex, cân phân tích, máy lắc, waterbath, cân điện tử, máy đo độ ẩm, máy đo pH và một số dụng cụ khác.
Hóa chất: Dung dịch Iod, HCL 30%, Ethanol 95%, NaOH 0.1N, NaOH 1N, Thymolblue, Na2CO3, CuSO4, và một số dung dịch khác.
2.2 PHƯƠNG PHÁP
2.2.1 Các bước tiến hành thí nghiệm
Bước 1: Do điều kiện về kinh phí không đủ để thực hiện đề tài tại đồng ruộng nên đã lấy đất từ hộ ông Trần Quốc An tại huyện Hồng dân tỉnh Bạc Liêu đem về thực hiện tại Phòng thí nghiệm Chọn giống và ứng dụng công nghệ sinh học, Bộ môn Di truyền giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng trường Đại Học Cần Thơ
Bước 2: Xử lý đất và kết hợp bón vôi (2,45g/chậu ≈ 500 kg/ha) và phân lân nhằm mục đích giảm phèn và loại bỏ các tạp chất trong đất.
Bước 3: Trộn đều và bố trí đất đã xử lý vào 20 chậu theo kiểu bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và thêm nước ngập mặt đất từ 3 – 5cm.
Bước 4: Nhận 150 hạt giống CTUS4 từ quần thể giống ban đầu và xử lý miên trạng sau đó để cho nảy mầm và cấy vào trong chậu đất đã chuẩn bị sẵn.
Bước 5: Đo mặn nước 20 chậu bằng máy đo độ mặn cầm tay Maxtini instruments Mi 306 hằng ngày trong điều kiện nhà lưới.
20
Bước 7: Theo dõi và đánh giá khả năng chịu mặn, phèn của giống lúa đồng thời thêm nước vào chậu cho ngập từ 3 – 5cm nhằm đảm bảo lúa phát triển bình thường cho đến khi thu hoạch.
Bước 8: Sau khi thu hoạch lúa ở vụ 1 tiếp tục trồng trong điều kiện mặn (20 chậu) và phân tách dòng.
Bước 9: Tiếp tục nhân lên trong điều kiện thí nghiệm đất bình thường, thu thành từng dòng. Phân tích các chỉ tiêu nông học, chỉ tiêu chất lượng (amylose, protein,…).
2.2.2 Phương pháp đo độ mặn nước
Tiến hành đo độ mặn từng chậu bằng máy đo độ mặn cầm tay Maxtini instruments Mi 306, thời gian đo vào buổi chiều lúc 15-17h. Điều chỉnh máy về chế độ đo EC (ms/cm), sau đó đặt điện cực của máy vào chậu sao cho ngập điện cực, quan sát kết quả hiện trên máy đến khi số trên máy không còn dao động thì ghi nhận lại kết quả. Sau đó quy đổi số liệu về đơn vị phần ngàn (‰) theo công thức:
EC(‰) = 0,64 x EC(nước) (ms/cm) (Nguyễn Mỹ Hoa và ctv., 2012)
2.2.3 Phương pháp đánh giá độ mặn đất
Đất được lấy về và được phân tích bằng phương pháp trích bão hòa (Phân tích các chỉ tiêu: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, ECe) tại Phòng Thí Nghiệm Chuyên Sâu, Trường Đại Học Cần Thơ.
2.2.4 Phương pháp thu thập và đánh giá các chỉ tiêu nông học
Chiều cao cây
Tiến hành đo chiều cao cây vào lúc chuẩn bị thu hoạch. Đo từ mặt đất đến chóp bông cao nhất của mỗi bụi, thực hiện 3 lần lặp lại cho mỗi lô và thực hiện cho tất cả các lô của mỗi giống.
Chiều dài bông
Khi thu hoạch, tiến hành đo chiều dài bông. Đo từ cổ bông đến chóp bông và tính chiều dài trung bình của giống.
Chiều dài lá
Chiều dài và chiều rộng lá cờ (cm) được lấy vào lúc thu hoạch, chiều dài lá cờ được đo từ cổ lá đến chóp của lá cờ, chiều rộng của lá được đo ở phần rộng nhất của lá, thực hiện 5 lần lặp lại.
Thời gian sinh trưởng
Thời gian sinh trưởng là thời gian được tính từ lúc hạt nẩy mầm cho đến khi thu hoạch (khi bông lúa chín từ 85% bông trở lên trên toàn lô). Đối với lúa cấy thì thời gian này được trừ đi 5 ngày (thời gian để cây lúa phục hồi sau cấy). Thời gian sinh trưởng được phân nhóm như bảng 2.1.
Bảng 2.1 Bảng phân loại nhóm lúa theo thời gian sinh trưởng
Nhóm lúa Thời gian sinh trưởng (ngày)
Lúa cực sớm (A) 75-90 Lúa ngắn ngày (B) 90-120
B0 90-100
B1 100-110
B2 110-120
Lúa trung mùa 120-150
Lúa mùa (D) >150
2.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU PHẨM CHẤT
2.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein
Tiến hành theo phương pháp Lowry O.H (1951). Bước 1: chuẩn bị dd ly trích
+ Dung dịch NaOH 0,1N.
+ Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,05% +NaOH 0,1N). + Dung dịch B (CuSO4 0,1%).
+ Dung dịch C (gồm dd A+B theo tỷ lệ A : B = 45 : 5). + Dung dịch Folin 1N.
Bước 2: chuẩn bị mẫu
+ Cân 10mg bột gạo + 1ml NaOH 0,1N. + Lắc ít nhất 2 giờ hay để qua đêm. Bước 3: pha loãng mẫu và đo
+ Ly tâm mẫu ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
+ Hút 100 µl mẫu + 100 µl nước cất + 5ml dung dịch C. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 100 µl NaOH 0,1N.
+ Trộn đều và để yên trong 10 phút.
+ Thêm 50 µl Folin 1 N, trộn đều và để yên trong 30 phút.
+ Lắc đều mẫu, sau đó cho vào cuvette và đo ở bước sóng 580 nm. Bước 4: dựng đường chuẩn và tính kết quả
+ Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). + Đường chuẩn có dạng :
22
Y = aX + b
+ Trong đó: Y là độ hấp thu OD.
X là nồng độ protein có trong mẫu đem đo (mg/ml). + Hàm lượng protein được tính theo công thức:
Phần trăm Protein (%P) =
m X
x 100 Với: m là trọng lượng thực của mẫu m =
14 100 %) 100 ( 10 H
Trong đó: H% độ ẩm của mẫu
2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng amylose.
Bước 1: chuẩn bị hóa chất + Ethanol 95%. + HCl 30%. + NaOH 1N.
+ Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI). Bước 2: chuẩn bị mẫu
+ Cân 50mg bột gạo đã được nghiền mịn, cho vào ống 50ml. + Thêm 0,5 ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều.
+ Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Đun sôi trong 10 phút và lắc đều. + Để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: pha loãng và đo mẫu
+ Rút 100 µl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử hay dịch trích bằng 100 µl NaOH 1 N).
+ Thêm nước cất khoảng ½ bình và lắc đều. + Thêm 250 µl dd Iod, lắc đều.
+ Thêm nước cất đến vạch định mức.
+ Chuyển sang ống 50ml, lắc đều và để yên trong 30 phút.
+ Lắc đều trước khi cho vào cuvette. Đo độ hấp thu ở bước sóng 580 nm. Bước 4: xây dựng đường chuẩn và tính kết quả.
+ Đường chuẩn có dạng : Y = aX + b
X là lượng Amylose có trong 1ml mẫu, đọc từ máy (mg/ml). + Tính hàm lượng amylose theo công thức :
% Amylose =
100
X
x 100
Bảng 2.2 Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lượng amylose cho lúa (IRRI,1988)
Nhóm Hàm lượng amylose (%) Gạo nếp 0 – 2 Gạo tẻ: Rất thấp 3 – 9 Thấp 10 – 19 Trung bình 20 – 25 Cao > 25 2.3.3 Phương pháp xác định cấp độ trở hồ
+ Tiến hành theo phương pháp của IRRI (1979).
+ Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng được thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chon hạt không bị nứt, để vào đĩa Petri.
+ Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi đĩa.
+ Đậy đĩa Petri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.
+ Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1979) được trình bày ở Bảng 2.3.
Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức: Cấp trở hồ =
N n i x Trong đó: xi: cấp trở hồ. n: số hạt có cấp độ trở hồ xi. N: số hạt thử nghiệm.
Cấp trở hồ được đánh giá theo thang điểm IRRI (1979). (Bảng 2.4)
24
Cấp Độ lan rộng
1 Hạt gạo còn nguyên
2 Hạt gạo phòng lên
3 Hạt gạo phòng lên; viền còn nguyên hay rõ nét. 4 Hạt gạo phòng lên; viền còn nguyên và mở rộng. 5 Hạt rã ra; viền hoàn toàn nở rộng.
6 Hạt tan ra hòa chung với viền. 7 Hạt ta hoàn toàn và quyện vào nhau
Bảng 2.4 Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm IRRI (1979)
2.3.4 Phương pháp xác định độ bền thể gel
Theo phương pháp của Tang et.,al (1991). Bước 1: Chuẩn bị mẫu
+ Tách vỏ trấu và đo ẩm đọ hạt gạo.
+ Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ12%). Bước 2: Hòa tan mẫu
+ Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue. + Thêm 2 ml KOH 0,2N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex.
+ Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 1000C) khoảng 5 phút. + Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong nồi nước đá 10 phút. Bước 3: Đọc và ghi kết quả
+ Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt phẳng, dể gel chảy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel).
Đánh giá độ bền thể gel theo thang điểm IRRI (1996) như được trình bày ở Bảng 2.5.
Bảng 2.5 Phân cấp độ bề thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996)
Cấp Độ trở hồ
1 – 3 Cao
4 – 5 Trung bình
Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel 1 80 – 100 Rất mềm 3 61 – 80 Mềm 5 41 – 60 Trung bình 7 35 – 40 Cứng 9 < 35 Rất cứng
2.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
26
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẤT Bảng 3.1 Kết quả phân tích đất
Tên chỉ tiêu Phương pháp thử Kết quả
pH 2,97
EC (mS/cm)
Trích bão hòa
11,55
Từ kết quả phân tích đất ở bảng 3.1 và bảng phân loại đất mặn (FAO,1985) ta có thể phân loại đất được lấy để thí nghiệm là thuộc nhóm đất mặn vừa nằm trong khoảng EC từ 9-18.
Dựa vào kết quả phân tích đất (bảng 3.1) của mẫu đất đem đi phân tích có pH là pH = 2.97 và dựa theo Bảo Tàng đất Việt Nam thì kết luận rằng đất phèn hay đất phèn chua là là thuật ngữ dùng để chỉ loại đất có pH thấp, thường là từ 5.5 trở xuống, có khi pH là 2 hay 3. Lúa bị ngộ độc phèn thể hiện bằng sự kém đẻ nhánh, cây lùn lại, hạt lép nhiều , kém nở bụi. Nếu không có biện pháp khắc phục thì năng suất sẽ rất thấp.
( Nguồn: http://baotangdat.blogspot.com/2011/12/at-phen-va-viec-bon-cai-tao.html )
Theo bảng phân loại đất mặn dựa vào sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng (Abrol và ctv., 1988) vàđộ dẫn điện EC thì chỉ có vài loại cây có khả năng chống chịu được mới cho được năng suất, còn những cây không có khả năng chống chịu được thì sẽ bị chết ngay từ khi còn ở giai đoạn mạ hay sẽ chết trong thời kì sinh trưởng hoặc không có khả năng cho năng suất.
pH thấp gây ảnh hưởng trực tiếp đến sự hấp thu các dưỡng chất làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. Quan trọng nhất là pH thấp đưa đến nồng độ Fe, Al và Mn rất cao gây ngộ độc cho cây trồng. Mặt khác, pH thấp làm giảm đáng kể độ hữu dụng của N, P, Ca, Mg trong đất, gây ra hiện tượng thiếu dinh dưỡng cho cây trồng. (Giáo trình các trở ngại của đất trong sản xuất nông nghiệp – Võ Thị Gương, Tất Anh Thư).
Từ tất cả các phân tích ở trên ta có thể kết luận rằng đất đem đi phân tích và làm thí nghiệm là thuộc loại đất phèn – mặn vừa.
Hình 3.1 Giá trị đo pH khi lúa được trồng trong chậu (hình a) và biểu hiện phèn (hình b)
3.2 THEO DÕI TÌNH HÌNH DIỄN BIẾN MẶN VÀ GHI NHẬN KẾT QUẢ MẶN CỦA 20 CHẬU SAU KHI CẤY (VỤ 1) CỦA 20 CHẬU SAU KHI CẤY (VỤ 1)
3.2.1 Diễn biến mặn của 20 chậu thí nghiệm
Sau khi đem đất về phòng thí nghiệm tiến hành xử lý đất để loại bỏ tạp chất và được bố trí vào 20 chậu và tiến hành đo độ mặn hằng ngày để lấy chỉ tiêu sau đó theo dõi tình hình sinh trưởng và phát triển của cây lúa.
Dựa vào bảng 3.2 bảng trung bình diễn biến độ mặn (‰) của 20 chậu trong suốt 10 tuần thí nghiệm cho ta thấy diễn biến mặn của các chậu thay đổi theo thời gian từ lúc trồng cho đến lúc thu hoạch và chậu có độ mặn trung bình thấp nhất là chậu 1 (2,54‰) và chậu có giá trị mặn trung bình cao nhất là chậu 12 (5,58‰). Tuy đất được lấy ở cùng thời điểm và cùng địa điểm nhưng có sự khác nhau về độ mặn giữa các chậu có thể là do nguyên nhân đất có cấu tạo chưa đồng đều, lượng đất cho vào mỗi chậu khác nhau hay khác nhau về chế độ nước thêm cho mỗi chậu hoặc vì nhiều nguyên nhân khác.
28 Tuần Chậu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Giá trị TB 1 2,69 3,53 2,92 3,57 2,13 2,07 0,89 3,54 1,58 2,49 2,54 2 2,74 4,79 4,17 6,06 3,73 3,51 0,78 4,97 2,00 3,39 3,61 3 2,75 5,30 4,79 5,51 3,35 3,78 1,89 6,05 2,84 4,16 4,04 4 3,09 4,25 3,71 5,30 3,43 4,06 1,09 5,25 1,78 3,43 3,54 5 2,53 3,64 4,27 4,83 2,62 3,26 0,56 4,41 2,03 3,00 3,11 6 2,56 3,91 3,95 4,78 3,43 4,09 1,20 4,85 1,53 3,07 3,33 7 2,87 4,80 4,95 7,07 4,92 5,56 3,05 9,35 5,67 6,34 5,45 8 2,90 4,36 3,83 5,17 3,68 3,99 1,40 5,44 1,92 3,53 3,62 9 3,18 4,92 4,09 5,20 3,60 4,07 1,72 5,85 2,56 3,93 3,91 10 2,58 4,07 5,00 6,29 4,03 4,05 2,22 7,18 4,70 4,99 4,51 11 2,64 4,36 4,57 6,13 4,42 4,27 2,65 7,51 4,35 5,07 4,60 12 3,14 4,80 5,10 6,78 5,26 5,89 2,69 9,58 6,06 6,55 5,58 13 3,13 4,24 4,54 5,92 4,34 4,49 2,53 7,95 4,86 5,41 4,74 14 2,81 4,83 3,34 5,13 2,70 3,05 2,11 4,70 1,79 3,07 3,35 15 2,59 3,96 4,48 4,06 3,10 2,46 0,91 3,94 0,93 2,63 2,90 16 2,91 3,89 4,86 6,19 4,16 4,38 1,16 7,05 3,98 4,90 4,35 17 3,37 4,20 4,99 6,67 4,77 5,41 2,61 8,03 2,42 4,25 4,67 18 3,06 4,76 4,66 5,30 2,89 3,41 1,79 5,22 1,86 3,40 3,63 19 2,81 4,80 4,23 6,70 4,42 5,02 2,16 7,00 2,60 4,51 4,42 20 2,60 3,41 2,98 3,76 3,55 3,44 1,66 4,62 0,98 2,79 2,98
Ngoài ra diễn biến mặn trong cùng một chậu cũng khác nhau giữa các ngày đo, cá biệt có chậu lên đến 9,58‰ vào tuần thứ 8 (chậu 12) và chậu thấp nhất là 0,56‰ vào
tuần thứ 7 (chậu 5). Sự biến thiên độ mặn của các chậu trong suốt thời gian thí nghiệm được lý giải bởi các nguyên nhân sau:
Chế độ nước: vào giai đoạn đầu cây lúa còn nhỏ nên mực nước được giữ ở mức thấp để tránh tình trạng bị stress do ngập, mực nước được tăng lên theo sự phát triển của cây lúa cho đến khi lượng nước trong chậu đạt mức từ 3-5 cm và giảm dần mực nước ở giai đoạn cuối sắp thu hoạch.
Yếu tố nhiệt độ: cùng với chế độ nước như trên kết hợp với thời tiết có mưa vào buổi trưa, nhiệt độ thấp ở giai đoạn đầu vụ dẫn đến độ mặn cao. Đến giai đoạn tượng khối sơ khởi, làm đồng, trổ và chín nhiệt độ tăng cao lên đến 38oC - 40oC lượng nước bốc hơi nhiều làm cho độ mặn tăng cao vào cuối vụ lúc sắp thu hoạch (tuần 11, 12 sau khi cấy). Yếu tố thời gian: Thời gian đo mặn trung bình từ 16h – 17h. Tuy nhiên vẫn chưa thống nhất được một giờ nhất định nên kết quả mặn có thể thay đổi do thời gian đo bị thay đổi.
Kết quả đo mặn so với kết quả của mẫu đất đem đi phân tích có sự chênh lệch khá lớn (đo đất là 7,392‰ còn kết quả đo mặn nước trung bình từ 2-5‰) nguyên nhân chủ yếu là do đất sau khi đem về phòng thí nghiệm được trích 1 phần đi phân tích tại phòng thí nghiệm chuyên sâu (khu II, đường 3 tháng 2 TP. Cần Thơ), phần còn lại được xử lý, bón thêm vôi và phân lân rồi sau đó mới cho vào các chậu, trong thời gian sinh trưởng và phát triển của lúa cần cung cấp thêm nước để đảm bảo cho cây lúa sinh trưởng và phát